Dúvida sobre análise de imagens
28 Janeiro 2019, 14:42 • Rui Manuel dos Santos Malhó
Resposta a dúvida colocada por um de vós ao Luis Marques sobre análise de imagens:
As imagens / experiências diferentes geralmente não são directamente
comparáveis, apesar de se tentar usar a mesma objectiva, câmara,
exposição, etc. Depende da preparação, dos lotes dos reagentes, de
poderem ter sido feitas em alturas diferentes, da resposta do
material... Etc. No fim temos imagens cuja intensidade de fluorescência
capturada - seja o próprio objecto (pelo), seja o background - varia
entre amostras e não há um padrão comum.
Isto pode contornar-se de duas formas:
1. Comparar rácios: desenhas uma linha ao longo do pelo como vos mostrei, e pedes ao FIJI para mostrar o PLOT PROFILE (Analyze>Plot Profile) da intensidade da fluorescência ao longo da linha. No gráfico que aparece há um botão LIST com os valores de X (distância em micra ou pixels) e Y (valor do nível de cinzento) do gráfico. A coluna Y dá-te então um conjunto de valores de fluorescência ao longo da linha. Se moveres a linha para uma zona de background, novo Plot Profile e List dão-te novos valores de fluorescência (nova Coluna Y). Para fazer o rácio, copiamos a coluna X (será igual, dado que a linha é a mesma) e ambas as colunas Y para o Excel e fazemos uma nova coluna com uma operação tipo (Fluo no pelo) / (Fluo no Background). Fazendo um gráfico com esse resultado em Y contra a coluna X original, temos a tal representação de "quantas mais vezes o sinal no pelo é mais intenso do que o background". Se fizeres um gráfico deste rácio para cada imagem, podes comparar os rácios entre si - e até plotar directamente todos ao mesmo tempo se a linha original for do mesmo tamanho em todas as imagens (hoje sugeri a colegas traçar sempre o mesmo tamanho de linha a partir do ápice do pelo, nas diferentes imagens).
2. Subtrair o background de forma ponderada a todas as imagens: nesta operação assumimos que as imagens têm um valor de intensidade de sinal e background diferentes, mas vamos usar uma função matemática que vai aproximar o background de todas de zero, para todas terem mais ou menos o mesmo "ponto de partida". Em primeiro lugar, aplicamos a LUT HiLo a cada imagem, para podermos avaliar a correção para perto do zero/pretos do background (queremos um pontilhado azul, uma vez que a HiLo pinta de azul os pixeis pretos). A seguir usamos a função Process>Subtract Background. Não coloques checks em nada, tirando no preview para ver o resultado. Em rolling ball radius, a regra é colocar o DOBRO do valor em pixeis do tamanho da estrutura que nos interessa, para o algoritmo saber demarcar o que é sinal do que é background. Assim, previamente tens de medir, por exemplo o tamanho do teu pelo na imagem, com a ferramenta de linha e Analyze>Measure. Se medir, p.e., 200 pixeis, tens de colocar 400 no rolling ball radius. Aplica esse subtract background, e faz isso a todas as imagens (pode ser útil todas as imagens terem originalmente o mesmo tamanho de pelo e dimensão de imagem... Podem fazer isso fazendo selecções rectangulares específicas (Edit>Selection>Specify) à volta do pelo e Image>Crop para essa selecção.) Grosso modo, depois podes fazer gráficos para cada imagem directamente a partir de cada plot profile, que vão ser ... "comparáveis" ... entre si.
Só mais 4 achegas:
- todas as operações realizadas às imagens têm de ser descritas (sucintamente)
- todas estas quantificações SÓ SE PODEM REALIZAR EM IMAGENS TIFF NÃO MANIPULADAS. Ou seja, nada de brightness/contrast, etc.
- não esquecer que uma boa forma de aumentar o "n" (número de
replicados) em cada imagem de valores de fluorescência dentro do mesmo
pelo, é fazer variar a espessura da linha, clicando duas vezes no botão
da linha
- uma vez que o "n" (número de replicados) é importante para a
robustez dos dados de qualquer experiência, acho importante que tentem
extrair o maior número de dados possível e que possam ser comparados de
forma legítima. É interessante saber não só se tratamentos diferentes
dão intensidades diferentes relativamente ao controlo, como também se os
vossos controlos são consistentes entre si.