Aulas 5-6

14 Maio 2019, 13:00 • Solveig Thorsteinsdottir

AULA 5

O primeiro dia de hibridação in situ com os embriões de galinha obtidos na aula 4.

Dia 1 da hibridação in situ:

Rehidratação dos embriões:

  1. Colocar em (encher 2/3 do tubo):

75% metanol em PBT 5 min

50% metanol em PBT 5 min

25% metanol em PBT 5 min

  1. Lavar 2 vezes em PBT

Permeabilização e posterior fixação dos embriões:

  1. Permeabilização dos embriões em proteinase K em PBT a 10 mg/ml (stock a 20 mg/ml: 25 µl PK – 50 ml PBT) a temperatura ambiente. O tempo de permeabilização depende do estádio do embrião (estádio HH = minutos; e.g. estádio HH10 = 10 min).
  2. Lavar 2 vezes em PBT a temperatura ambiente. Cuidado: os embriões são frágeis!
  3. Pós-fixação dos embriões durante 20 min a temperatura ambiente
  4. Lavar 2 vezes em PBT a temperatura ambiente

Preparação dos embriões para hibridação in situ:

  1.  Passar por mistura PBT:Hibmix (1:1) (previamente aquecida até 70ºC)
  2.  Passar por Hibmix (70ºC)
  3.  Incubar em Hibmix durante 1 h a 70ºC

Hibridação in situ:

  1. Tirar Hibmix e colocar Hibmix com sonda (só o suficiente para cobrir os embriões!) e incubar “overnight” a 70ºC*.

(Sonda tem todos os U’s conjugados com a proteina dioxigenina (DIG))

* temperatura depende das características da sonda

 

AULA 6

 

Este procedimento foi feito nos dias 15 e 16 de abril.

Continuação da aula anterior. Foi executado o protocolo do segundo e terceiro dia de hibridação in situ segundo o seguinte protocolo. Nota que os alunos fizeram esta aula no horário que tinham disponível nos dias 15 e 16 de abril, totalizando 4 horas de aula.

Dia 2 da hibridação in situ:

Lavagens pós-hibridação:

  1.  Recuperar Hibmix com sonda (não deitar fora!!) e guardar a -20ºC.
  2.  Lavar os embriões 2 vezes com Hibmix previamente aquecida
  3.  Lavar 30 min com Hibmix a 70ºC (usar aprox. 1.5 ml)
  4.  Lavar 10 min com mistura Hibmix: TBST (1:1; previamente aquecida). Deixar a temperatura ambiente para arrefecer lentamente.
  5.  Lavar 2 vezes em TBSTa temperatura ambiente
  6.  Lavar 15 min em TBST no “roller”

Preparação para detecção da sonda por imunohistoquímica:

  1. Incubar em TBST com 2% blocking e 20% soro de ovelha durante 1 h a temperatura ambiente no “roller”

Detecção da sonda por imunohistoquímica:

  1.  Adicionar o anticorpo anti-DIG conjugado com fosfatase alcalina (diluido 1:2000 em TBST com 2% blocking e 20% soro) e incubar “overnight” a 4ºC

Dia 3 da hibridação in situ

Lavagens pós-imunohistoquímica:

  1.  Lavar 3 vezes em TBST a temperatura ambiente
  2.  Lavar 3 vezes 1 hora em TBST com agitação a temperatura ambiente no “roller”
  3.  Deixar a 4ºC em TBST até a próxima aula