Hibridação in situ em embriões de galinha - dias 2 e 3
11 Abril 2018, 13:00 • Solveig Thorsteinsdottir
Este procedimento foi feito nos dias 11 e 12 de abril.
Continuação da aula anterior. Foi executado o protocolo do segundo e terceiro dia de hibridação in situ segundo o seguinte protocolo. Nota que os alunos fizeram esta aula no horário que tinham disponível nos dias 11 e 12 de abril, totalizando 4 horas de aula.
Dia 2 da hibridação in situ:
Lavagens pós-hibridação:
- Recuperar Hibmix com sonda (não deitar fora!!) e guardar a -20ºC.
- Lavar os embriões 2 vezes com Hibmix previamente aquecida
- Lavar 30 min com Hibmix a 70ºC (usar aprox. 1.5 ml)
- Lavar 10 min com mistura Hibmix: TBST (1:1; previamente aquecida). Deixar a temperatura ambiente para arrefecer lentamente.
- Lavar 2 vezes em TBSTa temperatura ambiente
- Lavar 15 min em TBST no “roller”
Preparação para detecção da sonda por imunohistoquímica:
- Incubar em TBST com 2% blocking e 20% soro de ovelha durante 1 h a temperatura ambiente no “roller”
Detecção da sonda por imunohistoquímica:
- Adicionar o anticorpo anti-DIG conjugado com fosfatase alcalina (diluido 1:2000 em TBST com 2% blocking e 20% soro) e incubar “overnight” a 4ºC
Dia 3 da hibridação in situ
Lavagens pós-imunohistoquímica:
- Lavar 3 vezes em TBST a temperatura ambiente
- Lavar 3 vezes 1 hora em TBST com agitação a temperatura ambiente no “roller”
- Deixar a 4ºC em TBST até a próxima aula