Sumários
Captura de imagens de leveduras vivas com microscopia de fluorescência
3 Novembro 2022, 08:00 • Federico Herrera Garcia
Estrutura, justificação e princípios para as aulas práticas de microscopia. Desenhamos uma célula de levedura e os seus componentes: núcleo, vacúolo, mitocôndria, membrana celular, parede celular, botão de fissão. As mitocôndrias também foram identificadas como a principal fonte de espécies reativas de oxigênio (ERO). Explicamos quais colorações usaríamos para visualizar o núcleo (Hoechst) e a parede (branco de calcofluor) e quantificar o número de células vivas e mortas (Live-or-dye), a quantidade de ROS (DCFHDA)nas células vivas. Explicamos que faríamos colorações duplas, usando dois fluorocromos compatíveis simultaneamente, um emitindo no espectro azul (Hoechst ou calcofluor white) e outro no espectro verde (DCFHDA), com exceção do Live-or-Dye, que emite no espectro vermelho. Os princípios desses ensaios e os conceitos de espectroscopia de imagem e excitação e emissão de fluorescência foram explicados brevemente, e alguns documentos técnicos adicionais foram enviados via Moodle para ilustrar essas explicações. O Hoechst se liga a ácidos nucleicos, com alguma preferência pelo DNA, e é permeável, tornando-o a escolha certa para a geração de imagens de núcleos celulares em células vivas. Uma coloração semelhante, DAPI, não é tão permeável e, portanto, é mais frequentemente usada para células fixadas. As diferenças entre trabalhar com células fixadas ou vivas também foram explicadas neste ponto. O calcofluor white liga-se aos açúcares na parede celular. O Live-or-Dye é impermeável e, portanto, só entra nas células mortas onde a membrana está danificada. O DCFHDA é permeável e metabolizado pelas esterasas quando entra nas células, liberando o DCFH, que por sua vez reage com as ROS e emite fluorescência no processo.
Também explicamos novamente o desenho experimental: comparando os parâmetros morfológicos e funcionais em uma cepa de levedura de controle versus uma cepa em que o gene Glo1 foi deleçonado. Como o Glo1 está envolvido na detoxificação do metilglioxal durante o estresse induzido pela glicação, hipotetizamos que as células mutantes deficientes em Glo1 podem ter um nível mais alto de estresse basal, disfunção mitocondrial, menor viabilidade ou alterações morfológicas imprevisíveis. No entanto, os estudantes foram alertados repetidamente que não devemos assumir que essas ou outras mudanças necessariamente aconteceriam, pois os organismos vivos têm mecanismos de adaptação que não entendemos completamente e estamos apenas removendo um gene. O objetivo foi fazer uma descrição das alterações morfológicas e funcionais observadas nas cepas mutantes versus controle, se houver. Para atingir esse objetivo, capturamos imagens de células de levedura vivas coloradas usando um microscópio de fluorescência wide field com uma objetiva de óleo 63X e uma câmara de alta resolução. Os alunos tiraram pelo menos 10 imagens em 10 campos diferentes para cada grupo experimental, adquirindo os 2 espectros correspondentes (azul / verde ou azul / vermelho) mais a luz transmitida para ter uma idéia da forma da levedura. Eles foram avisados de que, às vezes, as fotos que parecem boas quando são tiradas no microscópio podem ser muito difíceis de analisar no computador e, portanto, os estudantes devem tirar o máximo de fotos possível para ter material de trabalho suficiente. Alguns alunos confessaram mais tarde que não prestaram atenção suficiente a esse aviso, e os seus relatórios tiveram uma qualidade inferior devido a dificuldades de análise.As imagens foram guardadas para a sessão de análise de imagem.No final da aula, os alunos devem ter uma ideia clara das etapas básicas a serem seguidas para geração de imagens de células vivas.