continuação do tema 4. Clonagem de expressão

27 Março 2020, 08:00 • Rita Zilhão

Aula por video conferência colibri.zoom

Tags e genes repórter. Construção de proteínas híbridas ou de fusão. Produção de proteínas recombinantes em E. coli e em leveduras. Colunas de afinidade. Sistemas de deteção e purificação de proteínas. Expressão citoplasmática e expressão periplasmática ou secreção extracelular. Corpos de inclusão. Vetores eucarióticos de expressão: plasmídios e vetores derivados de vírus. Marcas eucarióticas de selecção de clones recombinantes. Sistemas e estratégias de clonagem de expressão. Promotores constitutivos e indutivos.

Início do tema 4. Clonagem de expressão

20 Março 2020, 08:00 • Rita Zilhão

Aula por video conferência colibri.zoom

4. Clonagem  de expressão

Sistemas de expressão homóloga e heteróloga de genes. Vantagens e desvantagens da expressão heteróloga em E. coli. Configuração de vetores procarióticos de expressão. Sistemas de expressão induzíveis (P_lac, P_T7; ex. pET system). Elevada eficiência de tradução. Continuação da Clonagem de expressão: Fusões transcricionais e fusões traducionais. Construção de proteínas híbridas ou de fusão.

Declaração de quarentena desde 10 Março.  Substituição a 16 de Março por vídeo conferência colibri.zoom. Continuação do tema 3.

13 Março 2020, 08:00 • Rita Zilhão

Declaração de quarentena desde 10 Março.

Substituição a 16 de Março por vídeo conferência colibri.zoom

Continuação dos vetores de clonagem: fagos, cosmídios, e fagemídios para clonagem em Escherichia coli. Cromossomas artificiais: PACs, BACs e YACs. Vetores de origem viral utilizados em células eucarióticas. Sistemas físicos e químicos de introdução de DNA em células procarióticas e eucarióticas: transformação, transdução, transfeção, eletroporação, microinjeção, bombardeamento de partículas.

Tipo de hospedeiros: hospedeiros procarióticos e principais hospedeiros eucarióticos (células animais e vegetais, linhas celulares, culturas primárias e tecidos). Características das células hospedeiras de E. coli. Selecção e identificação de clones recombinantes: a utilização de substratos cromogénicos, a inactivação funcional, a complementação de mutações definidas. Análise das construções de moléculas de DNA recombinante – por análise de restrição e por PCR.

continuação do tema 3. Metodologia da manipulação génica e clonagem molecular geral

6 Março 2020, 08:00 • Rita Zilhão

continuação do tema 3. Metodologia da manipulação génica e clonagem molecular geral

Métodos de produção de fragmentos de DNA e de modificação de extremidades (DNA polimerases, fosfatases de DNA, transferase terminal; adição de linkers e adaptadores). A variedade de sistemas de clonagem. Noção de sistema vetor/hospedeiro. Características fundamentais dos vetores de clonagem: origem de replicação, marca de seleção, “polylinker”. Vetores shuttle. Vetores de clonagem: plasmídios.

continuação do tema 2. Manipulação dos ácidos nucleicos: enzimologia, isolamento, quantificação e marcação

28 Fevereiro 2020, 08:00 • Rita Zilhão

continuação do tema  2. Manipulação dos ácidos nucleicos: enzimologia, isolamento, quantificação e marcação

Isoesquizómeros. Enzimas de modificação: nucleases, polimerases, fosfatases e cinases. DNA ligases. Propriedades físicas e químicas dos ácidos nucleicos e os seus métodos de visualização e quantificação. Fundamento de alguns processos de isolamento e purificação dos ácidos nucleicos. Métodos de quantificação dos ácidos nucleicos baseados na espectrofotometria e em matrizes (agarose e poliacrilamida) sujeitas a eletroforese.

3. Metodologia da manipulação génica e clonagem molecular geral

Clonagem molecular: significado, objectivos e etapas. O papel dos ácidos nucleicos na clonagem molecular. Construção de moléculas de DNA recombinante. Preparação de DNA vetor e DNA dador. Estratégias de ligação de DNA vetor e DNA dador (ligases de DNA). Clonagem dirigida e clonagem não dirigida.