Cont. de variantes da técnica de PCR e suas aplicações. 6. Tecnologia de hibridação e de marcação de sondas e 7. Análise dos genes clonados e dos seus produtos

26 Março 2021, 08:00 • Rita Zilhão

Cont. de variantes da técnica de PCR e suas aplicações: Nested-PCR, sistema ARMS, DOP-PCR. Técnicas de mutagénese dirigida baseada em PCR (PCR invertido e SOE-PCR (Splicing by overlapping extension).

6. Tecnologia de hibridação e de marcação de sondas

O que são técnicas de hibridação de ácidos nucleicos e o seu fundamento. Origem e caracterização das sondas de hibridação de ácidos nucleicos. Os diferentes tipos de sondas. Sondas homólogas, heterólogas e degeneradas. Condições de hibridação. Temperatura de fusão/desnaturação (Tm – melting temperature). 

Sistemas de marcação: marcação radioactiva e não-radioactiva de DNA. Noções muito gerais sobre marcação de DNA por nick translation, por primers aleatórios e de extremidades 5’ e 3’ do DNA. Como se obtêm sondas de RNA (ribossondas).

7. Análise dos genes clonados e dos seus produtos

Hibridação Southern e algumas aplicações (ex. DNA fingerprinting).

Continuação de Clonagem de expressão e 5. Técnica de PCR e variantes

19 Março 2021, 08:00 • Rita Zilhão

Vetores eucarióticos de expressão: plasmídios e vetores derivados de vírus. Marcas eucarióticas de seleção de clones recombinantes. Sistemas e estratégias de clonagem de expressão. Promotores constitutivos e indutivos.

Expressão transiente e expressão permanente. Sistemas de expressão génica induzível e condicional. Sistema tet-on/tet-off e sistema cre-lox.

5. Técnica de PCR e variantes

Revisão da história, princípios da técnica de PCR convencional e análise dos seus produtos. Características das polimerases de DNA utilizadas em PCR. A escolha dos primers. Estratégias de clonagem de produtos de PCR. Variantes da técnica de PCR e suas aplicações: a síntese de cDNA e a RT-PCR.

4. Clonagem de expressão

12 Março 2021, 08:00 • Rita Zilhão

Sistemas de expressão homóloga e heteróloga de genes. Vantagens e desvantagens da expressão heteróloga em E. coli. Configuração de vetores procarióticos de expressão. Sistemas de expressão induzíveis (P_lac, P_T7; ex. pET system). Elevada eficiência de tradução. Continuação da Clonagem de expressão: Fusões transcricionais e fusões traducionais. Construção de proteínas híbridas ou de fusão. Tags e genes repórter. Construção de proteínas híbridas ou de fusão. Produção de proteínas recombinantes em E. coli e em leveduras. Colunas de afinidade. Sistemas de deteção e purificação de proteínas. Expressão citoplasmática e expressão periplasmática ou secreção extracelular. Corpos de inclusão.

Continuação dos vetores de clonagem

5 Março 2021, 08:00 • Rita Zilhão

Continuação dos vetores de clonagem: fagos, cosmídios, e fagemídios para clonagem em Escherichia coli. Cromossomas artificiais: PACs, BACs e YACs. Vetores de origem viral utilizados em células eucarióticas. Sistemas físicos e químicos de introdução de DNA em células procarióticas e eucarióticas: transformação, transdução, transfeção, eletroporação, microinjeção, bombardeamento de partículas.

Tipo de hospedeiros: hospedeiros procarióticos e principais hospedeiros eucarióticos (células animais e vegetais, linhas celulares, culturas primárias e tecidos). Características das células hospedeiras de E. coli. Selecção e identificação de clones recombinantes: a utilização de substratos cromogénicos, a inactivação funcional, a complementação de mutações definidas. Análise das construções de moléculas de DNA recombinante – por análise de restrição e por PCR.

3. Metodologia da manipulação génica e clonagem molecular geral

26 Fevereiro 2021, 08:00 • Rita Zilhão

Clonagem molecular: significado, objectivos e etapas. O papel dos ácidos nucleicos na clonagem molecular. Construção de moléculas de DNA recombinante. Preparação de DNA vetor e DNA dador. Estratégias de ligação de DNA vetor e DNA dador (ligases de DNA). Clonagem dirigida e clonagem não dirigida.

Métodos de produção de fragmentos de DNA e de modificação de extremidades (DNA polimerases, fosfatases de DNA, transferase terminal; adição de linkers e adaptadores). A variedade de sistemas de clonagem. Noção de sistema vetor/hospedeiro. Características fundamentais dos vetores de clonagem: origem de replicação, marca de seleção, “polylinker”. Vetores shuttle. Vetores de clonagem: plasmídios.