Fertilização e desenvolvimento no ouriço-do-mar

21 Fevereiro 2017, 08:00 • Solveig Thorsteinsdottir

Aula prática sobre a fertilização o desenvolvimento precoce no ouriço-do-mar.

Objectivo 1: Observação de oócitos e espermatozóides

Objectivo 2: Observação da fertilização.

Objectivo 3: Observação das modificações que ocorrem ao nível do núcleo e citoplasma até a primeira divisão mitotica. Observação da segunda clivagem. Opcional: obervação de gastrulas e larvas pluteus no dia seguinte.

Objectivo 4: Executar uma experiência que testa o efeito da concentração dos espermatozóides no (1) sucesso da fertilização e (2) a incidência de polispermia. Elaboração de um gráfico com os resultados obtidos.

 

Protocolo da aula

Observação de oócitos:

·       Colocar uma gota de oócitos em água do mar numa lâmina e observar no microscópio (obj. 10x - não usar a objectiva de 40x!!). Identificar oócitos maduros e imaturos.

·       Adicionar uma gota muito pequena de tinta de China e misturar com um palito. Observar a geleia.

 

Observação de espermatozóides:

(só podem usar a objectiva de 40x COM LAMELA - a água do mar destrói objectivas!).

·       Preparar sémen diluído em água do mar. Observar com a objectiva de 10x sem lamela e depois colocar uma lamela e observar com a objectiva de 40x

 

Fertilização:

·       Preparar uma caixa de Petri com oócitos em água do mar. Colocar uma gota de oócitos numa lâmina, colocar no microscópio e focar com a objectiva de 10x.  Adiciona esperma diluído à caixa de Petri (vai ser usado para observar as fases de segmentação) e coloca uma gota de esperma na lâmina. Juntar a gota de esperma com a gota de oócitos usando um palito. Observar a fertilização.

 

Clivagem:

·          Retirar uma gota de embriões em clivagem da caixa de Petri e observar sem lamela com a objectiva de 10x. Observar a 1ª divisão mitótica (±40-50 min após a fertilização), a 2ª divisão mitótica (10-15 min após a 1ª) e a 3ª divisão mitótica (? min após a 2ª).

 

Concentração do esperma e a poliespermia

1.        em grupos de 4 (uma bancada) preparar 5 caixas de Petri (diâmetro 60 mm) com aproximadamente o mesmo número de oócitos em cada.

2.        diluir 1 gota de sémen concentrado em 45 ml de água do mar

3.        colocar 1, 5, 10,  20 e 40 gotas de semen diluido nas caixas com oócitos

4.        deixar desenvolver durante 40-50 minutos

5.        contar 50 oócitos ao acaso (de cada caixa) e classificar cada um num dos seguintes grupos:

                                  I.      não fertilizado

                                II.      fertilizado e normal

                               III.      fertilizado e poliespérmico

                               IV.      outro

6.        determinar se há uma correlação entre a quantidade de esperma administrado e a incidência de:

                                  I.      oócitos fertilizados

                                II.      oócitos poliespermicos

NOTA! Devem dimunir ao máximo o “bias” do observador. Se as contagens envolvem várias pessoas, têm que ter certeza que classifiquem os oócitos da mesma maneira.