Hibridação in situ dia 1
28 Março 2017, 13:00 • Solveig Thorsteinsdottir
O primeiro dia de hibridação in situ com os embriões de galinha obtidos na aula 3.
Dia 1 da hibridação in situ:
Rehidratação dos embriões:
- Colocar em (encher 2/3 do tubo):
75% metanol em PBT 5 min
50% metanol em PBT 5 min
25% metanol em PBT 5 min
- Lavar 2 vezes em PBT
Permeabilização e posterior fixação dos embriões:
- Permeabilização dos embriões em proteinase K em PBT a 10 mg/ml (stock a 20 mg/ml: 25 µl PK – 50 ml PBT) a temperatura ambiente. O tempo de permeabilização depende do estádio do embrião (estádio HH = minutos; e.g. estádio HH10 = 10 min).
- Lavar 2 vezes em PBT a temperatura ambiente. Cuidado: os embriões são frágeis!
- Pós-fixação dos embriões durante 20 min a temperatura ambiente
Fixador (tóxico!!): 45 ml PBT + 5 ml formaldeído à 37% + 200 ml glutaraldeído à 25%
- Lavar 2 vezes em PBT a temperatura ambiente
Preparação dos embriões para hibridação in situ:
- Passar por mistura PBT:Hibmix (1:1) (previamente aquecida até 70ºC)
- Passar por Hibmix (70ºC)
- Incubar em Hibmix durante 1 h a 70ºC
Hibridação in situ:
- Tirar Hibmix e colocar Hibmix com sonda (só o suficiente para cobrir os embriões!) e incubar “overnight” a 70ºC*.
(Sonda tem todos os U’s conjugados com a proteina dioxigenina (DIG))
* temperatura depende das características da sonda