Hibridação in situ dia 1

28 Março 2017, 08:00 • Solveig Thorsteinsdottir

O primeiro dia de hibridação in situ com os embriões de galinha obtidos na aula 3.

 

Dia 1 da hibridação in situ:

 

Rehidratação dos embriões:

 

  1. Colocar em (encher 2/3 do tubo):

75% metanol em PBT 5 min

50% metanol em PBT 5 min

25% metanol em PBT 5 min

  1. Lavar 2 vezes em PBT

 

Permeabilização e posterior fixação dos embriões:

 

  1. Permeabilização dos embriões em proteinase K em PBT a 10 mg/ml (stock a 20 mg/ml: 25 µl PK – 50 ml PBT) a temperatura ambiente. O tempo de permeabilização depende do estádio do embrião (estádio HH = minutos; e.g. estádio HH10 = 10 min).
  2. Lavar 2 vezes em PBT a temperatura ambiente. Cuidado: os embriões são frágeis!
  3. Pós-fixação dos embriões durante 20 min a temperatura ambiente

Fixador (tóxico!!): 45 ml PBT + 5 ml formaldeído à 37% + 200 ml glutaraldeído à 25%

  1. Lavar 2 vezes em PBT a temperatura ambiente

 

Preparação dos embriões para hibridação in situ:

 

  1.  Passar por mistura PBT:Hibmix (1:1) (previamente aquecida até 70ºC)
  2.  Passar por Hibmix (70ºC)
  3.  Incubar em Hibmix durante 1 h a 70ºC

 

Hibridação in situ:

 

  1. Tirar Hibmix e colocar Hibmix com sonda (só o suficiente para cobrir os embriões!) e incubar “overnight” a 70ºC*.

(Sonda tem todos os U’s conjugados com a proteina dioxigenina (DIG))

* temperatura depende das características da sonda