Aula 4
12 Abril 2022, 08:00 • Solveig Thorsteinsdottir
Processamento dos embriões de galinha recolhidos e fixados na aula anterior para coloração nuclear e a subsequente observação e aquisição de imagem em lupa ou microscópio de fluorescência (sala 2.1.15). Esta aula contou com o apoio do Luís Marques, técnico de microscopia.
Protocolo da aula:
COLORAÇÃO NUCLEAR DE EMBRIÕES DE GALINHA (2-3 dias) E A SUA OBSERVAÇÃO EM MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA
1. Calçar luvas e colocar os tubos com embriões de galinha da aula anterior num suporte para tubos.
2. Na HOTTE, retirar o fixador (4% PFA em PBS; tóxico) dos tubos utilizando uma pipeta Pasteur com ponta fina (marcada LIXO) e despejar o fixador no contentor do líxo tóxico líquido.
3. Encher o tubo até 2/3 do volume total com PBS e saír da hotte.
4. Deixar lavar em PBS durante 10 min com agitação. Retirar o PBS com uma pipeta Pasteur de ponta fina (marcada LIXO) e deitar o líquido no tubo do líxo líquido na sua bancada. Colocar PBS novo e lavar com agitação outros 10 min. Repetir uma terceira vez.
5. Depois da terceira lavagem colocar os embriões numa caixa de Petri com PBS e retirar o máximo das membranas extraembrionárias usando piças e a tesoura. Voltar a pôr os embriões no tubo com PBS.
6. Na HOTTE e usando uma micropipeta, colocar 200 µl do corante nuclear DAPI (5 µg/ml em PBS; tóxico) no tubo e incubar no escuro durante 2 min.
7. Na HOTTE retirar o DAPI com a micropipeta e colocar no tubo marcado “Lixo DAPI”. Encher os tubos com os embriões até 2/3 do volume total com PBS e saír da hotte.
8. Deixar lavar em PBS durante 10 min com agitação. Retirar o PBS com uma pipeta Pasteur de ponta fina (marcada LIXO) e deitar o líquido no tubo do líxo líquido na sua bancada. Colocar PBS novo e lavar outros 10 min.
9. Preparar uma caixa de Petri por grupo com 1% bactoagar em água a cobrir o fundo. Transferir os melhores embriões de cada estádio para esta caixa e, com as pinças, orientá-los da melhor maneira para a posterior captação de imagens. Retirar o excesso de PBS para que os embriões fiquem pousados em cima do agar. Escrever no lado da caixa o estádios HH dos embriões na caixa e indicar os vossos nomes/turma. No caderno, fazer um desenho da caixa indicando a posição e o estádio HH de cada embrião. Se tiverem muitos embriões bons, podem preparar uma segunda caixa.
10. Levar a caixa de Petri com os embriões para a Unidade de Microscopia (sala 2.1.15; https://fculmf.campus.ciencias.ulisboa.pt/) e observa-los utilizando a lupa de fluorescência (LUMAR) ou os microscópios de fluorescência (BX60 ou BX61). Faz aquisição de imagens com ajuda do técnico, Luís Marques.
Material: Luvas, PBS (Phosphate Buffered Saline), 5 µg/ml DAPI (4',6'-diamino-2-fenil-indol; tóxico), em PBS, pipetas de Pasteur de ponta fina, pipetas de Pasteur standard, micropipetas e pontas, lupa com iluminador, pinças (grossa/fina), tesoura fina, caixas de Petri, 1% bactoagar em água.