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IMPORTANTE: ANALISE CALCOFLUOR WHITE
12 Dezembro 2019, 12:06 • Federico Herrera Garcia
Bom dia a todos- Esta nota pode ser relevante para todos os grupos 3 e 4 todas as PLs, porque utilizaram calcofluor white nas suas amostras. O seu colega Miguel Ribeiro fez questão de pesquisar um bocadinho no analise das imagens de calcofluor, porque encontrava que deixava de fora muitas células que estavam no limiar do threshold e nas quais só se colorava a parede (apareciam como um anel depois de aplicar o threshold). Nestas células só contaba a área fluorescente (a parede), e não a área de todo o corpo das células, dando valores inferiores aos esperados para o tamanho da célula observado a olho. Ele mesmo resolveu o problema fazendo click no Analyze>Analyze particles>Include Holes. Desta maneira o programa inclui no cálculo a área dentro do anel, e os valores tornam-se mais reais. Esto não resolve o problema de aquelas células nas quais o perímetro seja discontinuo, porque então o interior não é reconhecido como um "Hole". Estas células deveram por tanto ser excluidas do analise.
Se já fizeram o análise e acham
que os datos representam a realidade, fiquem lá e defendam as suas
observações. Se não, pode ser recomendável repetir as suas
quantificações. Lembrem que o objetivo da microscopia é que descrevam o
melhor possível o que estão a observar.
Podem resolver dúvidas dos detalhes com o seu colega ou conmigo, mas vocês são os últimos responsáveis do seu análise!!
Cumprimentos,
MUITO IMPORTANTE: CALCULO DA INTENSIDADE DE FLUORESCÊNCIA
6 Dezembro 2019, 17:33 • Federico Herrera Garcia
Boa tarde,
O
vosso colega, Lucas Cardoso, fez uma observação muito importante
durante os cálculos da intensidade da fluorescência nas suas amostras
(Integrated density). Podem falar com ele dos detalhes, mas em resumo, o
ponto 4c do documento do Protocolo experimental (Procedures.doc) está
errado: depois de ter removido o background da imagem, não há que "Check
Set, then OK, then Apply" como diz nesse ponto. Depois de ajustar o
Threshold para definir o Background passam direitamente para o ponto 4d,
sem fazer Set ou Apply.
Depois de obter os datos de fluorescência, utilicem a Integrated density sem substraer ou fazer o ratio com a Área.
Muito obrigado ao Lucas pela sua pesquisa! Bom trabalho!
Bom fim de semana!
Cumprimentos,
Ultimas dicas para a confecção do relatório (na parte de Microscopia)
6 Dezembro 2019, 14:23 • Federico Herrera Garcia
Boa tarde, estudantes-
Há questões que parecem preocupar a alguns de vocês, e acho que devem ser respondidas:
MUITO IMPORTANTE Para os que trabalharam com DCFHDA e 123-Rhodamine: Alguns companheiros veram que quando fizeram o ratio entre a Integrated density e a area, os valores ficavam mesmo perto de 255. Acho agora que a Integrated density já contêm a área nos seus cálculos. NÃO FAÇAM O RATIO, sff. Podem simplesmente fazer como digo no protocolo original, e substraer a área da Integrated density.
Não existem resultados esperados. Devem descrever o que observam, sem prejuicios, como se faz em investigação. Eu mesmo não sei o que vai sair, e é possível que não existam diferências entre as estirpes, o ainda que existam diferências entre os diferentes PLs e grupos de práticas derivadas da preparação das amostras. Se não existem diferências entre os grupos experimentais, não existem. Se existem, descrevam. Mas sempre tentem procurar possíveis explicações para o que observam. Por exemplo: Alguns de vocês obtiveram resultados significativos em alguma magnitude de circularidade, mas não em outras. Pensem que cada magnitude tem em conta diferentes qualidades da forma das partículas, e a partir de ahí tentem justificar porqué existem tais diferências desde um ponto de vista técnico o biológico.
Nós não tratamos as células com MGO em momento nenhum. Estamos a comparar a estirpe controlo com a estirpe mutada para um gen em condições basais. Trabalhamos com a hipótese de que a perda do gen pode tornar as células mais estresadas, mas esta hipótese não tem porqué ser correta. Podem pensar em porqué, será bom para o relatório.
Vocês decidem cómo representar os datos obtidos na microscopía. Se espera uma descripção o mais completa e rigurosa possível do que observaram nas distintas estirpes. Se espera uma quantificação, uma media e um erro (desvio padrão), e um analise estadístico que determine se há ou não diferências significativas. Se espera uma imagem representativa da morfologia e fluorescência das duas estirpes, como explicado nas aulas. Sugestão: se ficarem sem espaço, sugero deixar no corpo do relatório os resultados mais significativos ou representativos, e passar para anexos aqueles resultados negativos ou menos relevantes.
O número mínimo de celulas a analizar é 100-150 por grupo experimental (estirpe controlo e estirpe mutada), conseguidas em um número mínimo de 3 fotografías. Mais fotografías e mais células é uma melhor representação das populações celulares que estão a descrever.
Sugerí que cada PL combinara para compartir os datos numéricos dos seus analises, para dar uma visão mais completa do fenótipo das duas estirpes, porque cada grupo fez diferentes colorações. Não é preciso, mas acho que enriquece o relatório. Para a imagem representativa, só é precisso utilizar as fotografias sacadas por vocês mesmos.
Lembrem-se que podem mudar a côr de um canal no imageJ assim: Image>Lookup tables. Assim podem crear um maior contraste entre cores como o azul e o verde.
Lembrem-se que podem tirar um canal que empata na imagem representativa no imageJ assim: Image>Color>Channels tool. Isto pode facilitar uma ilustração mais clara do que observam.
Lembrem-se que, se têm dificuldades para analizar algumas áreas da fotografía, podem fazer Crop a priori, para escolher áreas que sejam mais fáceis de analizar por separado.
Espero que isto ajude nas vossas escolhas.
Bom fim de semana!
Cumprimentos,
PL2: Organização das aulas de Microscopia proxima 5a e 6a
3 Dezembro 2019, 15:41 • Federico Herrera Garcia
PL5: Organização das aulas de Microscopia proximas 5a e 6a feiras
25 Novembro 2019, 14:09 • Federico Herrera Garcia