Sumários
Cinética enzimática, tratamento de dados
5 Novembro 2020, 14:00 • António Eduardo do Nascimento Ferreira
Tratamento de dados de cinética enzimática de glioxalase I em levedura: cálculo de velocidades iniciais a partir dos ensaios cinéticos. Cálculos das atividades específicas nas condições de ensaio para a estirpe de referência e para a estirpe deltaGLO1. Cálculo de parâmetros cinéticos a partir de dados de variação de substrato hemitioacetal.
Análise informático de imagens de fluorescência obtidas de amostras de leveduras vivas
5 Novembro 2020, 08:00 • Federico Herrera Garcia
Explicamos novamente as partes básicas duma levedura, os princípios de fluorescência, o desenho experimental e o objetivo final: comparar os parâmetros morfológicos e funcionais em uma cepa de levedura de controle versus uma cepa em que o gene Glo1 foi deleçonado. Como o Glo1 está envolvido na destoxificação do metilglioxal durante o estresse induzido pela glicação, hipotetizamos que as células mutantes deficientes em Glo1 podem ter um nível mais alto de estresse basal, disfunção mitocondrial, menor viabilidade ou alterações morfológicas imprevisíveis. No entanto, os estudantes foram alertados repetidamente que não devemos assumir que essas ou outras mudanças necessariamente aconteceriam, pois os organismos vivos têm mecanismos de adaptação que não entendemos completamente e estamos apenas removendo um gene. O objetivo é fazer uma descrição das alterações morfológicas e funcionais observadas nas cepas mutantes versus controle, se houver.
Para fazer uma descrição das alterações morfológicas e funcionais observadas nas cepas mutantes, capturamos imagens de células de levedura vivas coloradas usando um microscópio de fluorescência widefield com uma objetiva de óleo 63X e uma câmara de alta resolução, e analisamos as imagens com um software livre amplamente utilizado na comunidade de microscopia, denominado FIJI ou ImageJ. Os alunos instalaram esse programa nos seus computadores e aprenderam: 1) como abrir e processar uma imagem para análises morfológicas e quantitativas; 2) como analisar a morfologia das células e organelas; 3) como quantificar a intensidade de fluorescência de células e organelas; 4) como preparar uma imagem representativa, incluindo uma barra de escala e mudando as cores da imagem para atingir uma maior qualidade. Os procedimentos e outros detalhes técnicos foram definidos em vários documentos enviados para o Moodle e Fenix antes das aulas e estavam disponíveis ao longo do semestre. Esses documentos foram atualizados e refinados quando os alunos se familiarizaram com os procedimentos e começaram a fazer perguntas relevantes.
No final da aula, os alunos devem ter uma ideia clara das etapas básicas a serem seguidas para geração de imagens de células vivas e obter controle suficiente do software de análise de imagem para produzir resultados prontos para publicação, de alta qualidade.
DNA Gel
30 Outubro 2020, 08:00 • Rodrigo Freire Martins de Almeida
Análise dos resultados de PCR e do DNA genómico da levedura por electroforese em gel de agarose.
Análise informático de imagens de fluorescência obtidas de amostras de leveduras vivas
29 Outubro 2020, 14:00 • Federico Herrera Garcia
Explicamos novamente as partes básicas duma levedura, os princípios de fluorescência, o desenho experimental e o objetivo final: comparar os parâmetros morfológicos e funcionais em uma cepa de levedura de controle versus uma cepa em que o gene Glo1 foi deleçonado. Como o Glo1 está envolvido na destoxificação do metilglioxal durante o estresse induzido pela glicação, hipotetizamos que as células mutantes deficientes em Glo1 podem ter um nível mais alto de estresse basal, disfunção mitocondrial, menor viabilidade ou alterações morfológicas imprevisíveis. No entanto, os estudantes foram alertados repetidamente que não devemos assumir que essas ou outras mudanças necessariamente aconteceriam, pois os organismos vivos têm mecanismos de adaptação que não entendemos completamente e estamos apenas removendo um gene. O objetivo é fazer uma descrição das alterações morfológicas e funcionais observadas nas cepas mutantes versus controle, se houver.
Para fazer uma descrição das alterações morfológicas e funcionais observadas nas cepas mutantes, capturamos imagens de células de levedura vivas coloradas usando um microscópio de fluorescência widefield com uma objetiva de óleo 63X e uma câmara de alta resolução, e analisamos as imagens com um software livre amplamente utilizado na comunidade de microscopia, denominado FIJI ou ImageJ. Os alunos instalaram esse programa nos seus computadores e aprenderam: 1) como abrir e processar uma imagem para análises morfológicas e quantitativas; 2) como analisar a morfologia das células e organelas; 3) como quantificar a intensidade de fluorescência de células e organelas; 4) como preparar uma imagem representativa, incluindo uma barra de escala e mudando as cores da imagem para atingir uma maior qualidade. Os procedimentos e outros detalhes técnicos foram definidos em vários documentos enviados para o Moodle e Fenix antes das aulas e estavam disponíveis ao longo do semestre. Esses documentos foram atualizados e refinados quando os alunos se familiarizaram com os procedimentos e começaram a fazer perguntas relevantes.
No final da aula, os alunos devem ter uma ideia clara das etapas básicas a serem seguidas para geração de imagens de células vivas e obter controle suficiente do software de análise de imagem para produzir resultados prontos para publicação, de alta qualidade.