Apresentação e captura de imagens de leveduras vivas com microscopia de fluorescência

22 Outubro 2020, 08:00 • Federico Herrera Garcia

Estrutura, justificação e princípios para as aulas práticas de microscopia. Desenhamos uma célula de levedura e os seus componentes: núcleo, vacúolo, mitocôndria, membrana celular, parede celular, botão de fissão. As mitocôndrias também foram identificadas como a principal fonte de espécies reativas de oxigênio (ERO). Explicamos quais colorações usaríamos para visualizar o núcleo (Hoechst) e a parede (branco de calcofluor) e quantificar o número de células vivas e mortas (Live-or-dye), a quantidade de ROS (DCFHDA) ou a mitocôndria atividade (123-rodamina) nas células vivas. Explicamos que faríamos colorações duplas, usando dois fluorocromos compatíveis simultaneamente, um emitindo no espectro azul (Hoechst ou calcofluor white) e outro no espectro verde (DCFHDA ou 123-rodamina), com exceção do Live-or-Dye, que emite no espectro vermelho. Os princípios desses ensaios e os conceitos de espectroscopia de imagem e excitação e emissão de fluorescência foram explicados, e alguns documentos técnicos adicionais foram enviados via Moodle para ilustrar essas explicações. O Hoechst se liga a ácidos nucleicos, com alguma preferência pelo DNA, e é permeável, tornando-o a escolha certa para a geração de imagens de núcleos celulares em células vivas. Uma coloração semelhante, DAPI, não é tão permeável e, portanto, é mais frequentemente usada para células fixadas. As diferenças entre trabalhar com células fixadas ou vivas também foram explicadas neste ponto. O calcofluor white liga-se aos açúcares na parede celular. O Live-or-Dye é impermeável e, portanto, só entra nas células mortas onde a membrana está danificada. O DCFHDA é permeável e metabolizado pelas esterases quando entra nas células, liberando o DCFH, que por sua vez reage com as ROS e emite fluorescência no processo. A fluorescência de 123-rodamina colora as mitocôndrias ativas, embora o fluoróforo se difunda no citoplasma, e sua fluorescência é proporcional à atividade mitocondrial.

Os estudantes pegaram em 2 ml de culturas frescas de cepas de levedura controlo e mutantes, sedimentou as células, lavou-as com 1 ml de PBS e adicionou as colorações correspondentes. As células foram incubadas com as colorações no escuro e agitadas por 20 min. Durante esta incubação, foi explicado todo o procedimento para a preparação das amostras e a aquisição das imagens. As células foram então centrifugadas para remover o excesso de coloração e interromper a reação, lavadas 3 vezes com 1 ml de PBS e ressuspensas em 50 µl de PBS e 50 µl de glicerol para aumentar a viscosidade das amostras e evitar microcorrentes e movimento de leveduras / vibração durante a aquisição das imagens. Dez µl desta amostra concentrada foram colocados em uma lâmina de microscópio, montados com uma lamela de 1,5 de espessura e pressionados para colocar todas as células no mesmo plano focal. Alguns estudantes acharam isso complicado, pois muita pressão quebraria as células e muito pouco produziria artefactos devido a células em planos focais próximos, mas diferentes. Os procedimentos para trabalhar com o microscópio foram então explicados, e os alunos adicionaram uma gota de óleo de imersão ao objetivo 63X, colocaram a amostra em cima e localizaram as células no plano focal direito. Uma vez lá, explicamos novamente a estrutura e as partes de uma célula de levedura, desta vez com exemplos reais, e lembramos aos alunos os objetivos da prática: comparar a morfologia e a função das cepas de controlo e mutantes e preparar uma imagem representativa da microscopia para publicação. Os alunos tiraram pelo menos 10 imagens em 10 campos diferentes para cada grupo experimental, adquirindo os 2 espectros correspondentes (azul / verde ou azul / vermelho) mais a luz transmitida para ter uma ideia da forma da levedura. Eles foram avisados ​​de que, às vezes, as fotos que parecem boas quando são tiradas no microscópio podem ser muito difíceis de analisar no computador e, portanto, os estudantes devem tirar o máximo de fotos possível para ter material de trabalho suficiente. Alguns alunos confessaram mais tarde que não prestaram atenção suficiente a esse aviso, e os seus relatórios tiveram uma qualidade inferior devido a dificuldades de análise.

DNA - PCR

16 Outubro 2020, 08:00 • Rodrigo Freire Martins de Almeida

Extração do DNA de levedura. Realização de uma experiência de PCR.

Apresentação e captura de imagens de leveduras vivas com microscopia de fluorescência

15 Outubro 2020, 14:00 • Federico Herrera Garcia

Estrutura, justificação e princípios para as aulas práticas de microscopia. Desenhamos uma célula de levedura e os seus componentes: núcleo, vacúolo, mitocôndria, membrana celular, parede celular, botão de fissão. As mitocôndrias também foram identificadas como a principal fonte de espécies reativas de oxigênio (ERO). Explicamos quais colorações usaríamos para visualizar o núcleo (Hoechst) e a parede (branco de calcofluor) e quantificar o número de células vivas e mortas (Live-or-dye), a quantidade de ROS (DCFHDA) ou a mitocôndria atividade (123-rodamina) nas células vivas. Explicamos que faríamos colorações duplas, usando dois fluorocromos compatíveis simultaneamente, um emitindo no espectro azul (Hoechst ou calcofluor white) e outro no espectro verde (DCFHDA ou 123-rodamina), com exceção do Live-or-Dye, que emite no espectro vermelho. Os princípios desses ensaios e os conceitos de espectroscopia de imagem e excitação e emissão de fluorescência foram explicados, e alguns documentos técnicos adicionais foram enviados via Moodle para ilustrar essas explicações. O Hoechst se liga a ácidos nucleicos, com alguma preferência pelo DNA, e é permeável, tornando-o a escolha certa para a geração de imagens de núcleos celulares em células vivas. Uma coloração semelhante, DAPI, não é tão permeável e, portanto, é mais frequentemente usada para células fixadas. As diferenças entre trabalhar com células fixadas ou vivas também foram explicadas neste ponto. O calcofluor white liga-se aos açúcares na parede celular. O Live-or-Dye é impermeável e, portanto, só entra nas células mortas onde a membrana está danificada. O DCFHDA é permeável e metabolizado pelas esterases quando entra nas células, liberando o DCFH, que por sua vez reage com as ROS e emite fluorescência no processo. A fluorescência de 123-rodamina colora as mitocôndrias ativas, embora o fluoróforo se difunda no citoplasma, e sua fluorescência é proporcional à atividade mitocondrial.

Os estudantes pegaram em 2 ml de culturas frescas de cepas de levedura controlo e mutantes, sedimentou as células, lavou-as com 1 ml de PBS e adicionou as colorações correspondentes. As células foram incubadas com as colorações no escuro e agitadas por 20 min. Durante esta incubação, foi explicado todo o procedimento para a preparação das amostras e a aquisição das imagens. As células foram então centrifugadas para remover o excesso de coloração e interromper a reação, lavadas 3 vezes com 1 ml de PBS e ressuspensas em 50 µl de PBS e 50 µl de glicerol para aumentar a viscosidade das amostras e evitar microcorrentes e movimento de leveduras / vibração durante a aquisição das imagens. Dez µl desta amostra concentrada foram colocados em uma lâmina de microscópio, montados com uma lamela de 1,5 de espessura e pressionados para colocar todas as células no mesmo plano focal. Alguns estudantes acharam isso complicado, pois muita pressão quebraria as células e muito pouco produziria artefactos devido a células em planos focais próximos, mas diferentes. Os procedimentos para trabalhar com o microscópio foram então explicados, e os alunos adicionaram uma gota de óleo de imersão ao objetivo 63X, colocaram a amostra em cima e localizaram as células no plano focal direito. Uma vez lá, explicamos novamente a estrutura e as partes de uma célula de levedura, desta vez com exemplos reais, e lembramos aos alunos os objetivos da prática: comparar a morfologia e a função das cepas de controlo e mutantes e preparar uma imagem representativa da microscopia para publicação. Os alunos tiraram pelo menos 10 imagens em 10 campos diferentes para cada grupo experimental, adquirindo os 2 espectros correspondentes (azul / verde ou azul / vermelho) mais a luz transmitida para ter uma ideia da forma da levedura. Eles foram avisados ​​de que, às vezes, as fotos que parecem boas quando são tiradas no microscópio podem ser muito difíceis de analisar no computador e, portanto, os estudantes devem tirar o máximo de fotos possível para ter material de trabalho suficiente. Alguns alunos confessaram mais tarde que não prestaram atenção suficiente a esse aviso, e os seus relatórios tiveram uma qualidade inferior devido a dificuldades de análise.

Cinética enzimática

15 Outubro 2020, 14:00 • António Eduardo do Nascimento Ferreira

Cinética enzimática de glioxalase I nos extractos de levedura: extração por esferas de vidro e centrifugação, doseamento de proteína pelo método de Bradford. Ensaios cinéticos na estirpe de referência e estirpe deltaGLO1.

Cinética enzimática

15 Outubro 2020, 08:00 • António Eduardo do Nascimento Ferreira

Cinética enzimática de glioxalase I nos extractos de levedura: extração por esferas de vidro e centrifugação, doseamento de proteína pelo método de Bradford. Ensaios cinéticos na estirpe de referência e estirpe deltaGLO1.