Sumários

Continuação do tópico 4, e 5. Técnica de PCR e variantes

13 Abril 2018, 08:00 • Rita Zilhão

Continuação sw sistemas de expressão génica induzível e condicional. Sistema tet-on/tet-off e sistema cre-lox.

5. Técnica de PCR e variantes

História do PCR. Princípios da técnica de PCR convencional e análise dos seus produtos. Características das polimerases de DNA utilizadas em PCR. A escolha dos primers. Estratégias de clonagem de produtos de PCR. Variantes da técnica de PCR e suas aplicações: a síntese de cDNA e a RT-PCR, Nested-PCR, sistema ARMS, DOP-PCR e PCR multiplex. Técnicas de mutagénese dirigida baseada em PCR (PCR invertido e SOE-PCR (Splicing by overlapping extension). A utilidade do PCR em protocolos de screening.

Continuação do tópico 4

6 Abril 2018, 08:00 • Rita Zilhão

Continuação da Clonagem de expressão: Fusões transcricionais e fusões traducionais. Construção de proteínas híbridas ou de fusão. Tags e genes repórter. Construção de proteínas híbridas ou de fusão. Produção de proteínas recombinantes em E. coli e em leveduras. Colunas de afinidade. Sistemas de deteção e purificação de proteínas.

Expressão citoplasmática e expressão periplasmática ou secreção extracelular. Corpos de inclusão. Vetores eucarióticos de expressão: plasmídios e vetores derivados de vírus. Marcas eucarióticas de selecção de clones recombinantes. Sistemas e estratégias de clonagem de expressão. Promotores constitutivos e indutivos. Expressão transiente e expressão permanente.

Sistemas de expressão génica induzível e condicional. Sistema tet-on/tet-off.

Continuação do tópico 3, e 4. Clonagem de expressão

23 Março 2018, 08:00 • Rita Zilhão

Tipo de hospedeiros: hospedeiros procarióticos e principais hospedeiros eucarióticos (células animais e vegetais, linhas celulares, culturas primárias e tecidos). Características das células hospedeiras de E. coli. Selecção e identificação de clones recombinantes: a utilização de substratos cromogénicos, a inactivação funcional, a complementação de mutações definidas. Análise das construções de moléculas de DNA recombinante.

4. Clonagem de expressão

Sistemas de expressão homóloga e heteróloga de genes. Vantagens e desvantagens da expressão heteróloga em E. coli. Configuração de vetores procarióticos de expressão. Sistemas de expressão induzíveis (P_lac, P_T7; ex. pET system). Elevada eficiência de tradução.

Continuação da aula anterior (tópico 3)

16 Março 2018, 08:00 • Rita Zilhão

Continuação dos vetores de clonagem: fagos, cosmídios, e fagemídios para clonagem em Escherichia coli. O empacotamento de vírus de DNA in vitro. Cromossomas artificiais: PACs, BACs e YACs. Construção de bibliotecas genómicas. Vetores shuttle. Vetores utilizados em células eucarióticas. Sistemas físicos e químicos de introdução de DNA em células procarióticas e eucarióticas: transformação, transdução, transfeção, eletroporação, microinjeção, bombardeamento de partículas.

Continuação do tópico 3

9 Março 2018, 08:00 • Rita Zilhão

Métodos de produção de fragmentos de DNA e de modificação de extremidades (DNA polimerases, fosfatases de DNA, transferase terminal; adição de linkers e adaptadores). A variedade de sistemas de clonagem. Noção de sistema vetor/hospedeiro. Características fundamentais dos vetores de clonagem: origem de replicação, marca de seleção, “polylinker”. Vetores de clonagem: plasmídios.