Detecção e sequenciação de SARS-Cov-2

2 Dezembro 2021, 12:00 • Patricia Beldade

Seguimento do SARS-CoV-2 continuado, com alterações de protocolos e acumulação de dados em pouco tempo. 

1) Testes de diagnóstico de SARS-CoV-2 usando “quantititive real-time PCR” (qPCR). Material biológico isolado de pessoas (maioritariamente com zaragatoa intra-nasal mas também saliva) em que o vírus é neutralizado quimicamente antes de o RNA ser extraído (de forma automotizada e robotizada) nos laboratórios de diagnóstico. Protocolo em “one step”, com passagem de RNA a cDNA (com a enzima Reverse Transcriptase) seguida da amplificação do DNA (por qPCR), num mesmo tubo. Usam-se “primers” de PCR para material viral (e para gene humano como controlo) e detecta-se amplicões através da fluorescência emitida por “region-specific probes” (no caso dos laboratórios de diagnóstico certificados na Europe, usam-se 3 “probes” contra diferentes genes virais). Critérios de detecção baseados em valores de CT para as diferentes “probes”. Caso de “drop-out” em que uma das “probes” não funciona podem reflectir uma variante do vírus (e.g. “drop-out” nas variantes Delta e Omicron). 

2) Seguimento da origem e grupos de transmissão do SARS-CoV-2 usando técnicas de NGS (Nanopore e Illumina) e uma estratégia de amplificação do genoma viral via duas PCR multiplex cada uma com 48 pares de “primers” intercalados. Obtenção do primeiro genoma viral com recursos a RNA-seq e uma estratégia que enriquecia o RNA viral em detrimento do RNA do hospedeiro. Duas estratégias para lidar (bioinformaticamente) com as “reads” resultantes de sequenciação de novas amostras: “mapping” (contra o genoma de referência) ou “assembly” (“de novo”). Organização do genoma viral, taxa de mutação e identificação de “clusters”, incluindo estudos em Portugal que continuam a ser feitos. O que define uma nova variante: conjunto de mutações com particular enfoque no gene que codifica a proteína Spike do vírus. Nomenclatura das variantes. Interacção entre a Spike viral o o receptor humano Ace2. Plataformas públicas de armazenamento e visualização dos dados de sequência do genoma viral. Algumas variantes a ser seguidas incluindo Delta e Omicron; interesse na transmissibilidade e na virulência. Exemplos de eventos de “super-spreaders” (e.g.  festa da Latada em Coimbra) e de re-introduções recorrentes (e.g. “golfers” do Reino Unido no Algarve) em Portugal.

Aula lecionada em zoom pelo convidado, especialista em DNA sequencing & analysis, Doutor Ricardo Leite, coordenador da Unidade de Genómica do Instituto Gulbenkian de Ciência.