Sumários
Aplicações e exemplos da citometria de fluxo na biologia molecular e celular.
12 Outubro 2022, 08:00 • Rita Zilhão
Aplicações e exemplos da citometria de fluxo na biologia molecular e celular. Estudos de função celular (diferenciação, proliferação, apoptose). Diferenciação celular: análise do estado de activação das células, identificação de antigénios de superfície e intracelulares (vias de sinalização). Proliferação: análise da divisão celular (CFSE e VP450) e análise do ciclo celular (iodeto de propídio e BRdU). Apoptose (iodeto de propídio, anexina V). Deteção de células vivas vs mortas. Marcação intracelular. Deteção intracelular de espécies reativas de oxigénio (ROX). Tecnologias associadas à citometria de fluxo: sorteamento celular, Multiplex bead arrays, Amnis Image Stream, CyTOF, Single cell genomics, deteção de RNA (SmartFlare live cell detection e PrimeFlow RNA assay).
Citometria de fluxo
10 Outubro 2022, 09:00 • Rita Zilhão
Citometria de fluxo. Definição e fundamentos da citometria de fluxo: o que é a citometria de fluxo e como medi-la. Para que serve, vantagens e os diferentes citómetros. Descrição dos componentes do citómetro de fluxo: fluídica (ponto de interrogação, focagem hidrodinâmica, pressão diferencial (“flow rate”); óptica (sistema de lasers, emissão de luz - “foward scatter” (FSC) e “side scatter” (SSC) -, emissão de fluorescência – conjugar os diferentes fluorocromos, fluorescence spectra viwers, filtros; a eletrónica – detetores e processamento de sinal, como se mede, a importância da discriminação de dupletos; a digitilização e a apresentação dos resultados (histogramas, contour and density plots). Como preparar uma experiência de citometria de fluxo: a pergunta biológica, conhecer o citómetro que se usa, selecionar os reagentes (princípios e regras na escolha dos fluorocromos, a densidade antigénica, os anticorpos marcados em tandem, e preparar a amostra, controlos (biológicos, de qualidade, de coloração, de “gating”), optimização, configurar o instrumento (controlos de compensação e FMO) e a aquisição da amostra, a análise (representação dos resultados e “gating”) e estatística dos resultados (Mean e “Median fluorescence intensity” (MFI), softwares de tratamento de dados) a publicação dos resultados (Myflowcyt). Fontes úteis de consulta e estudo.
Citometria de fluxo
10 Outubro 2022, 08:00 • Rita Zilhão
Citometria de fluxo. Definição e fundamentos da citometria de fluxo: o que é a citometria de fluxo e como medi-la. Para que serve, vantagens e os diferentes citómetros. Descrição dos componentes do citómetro de fluxo: fluídica (ponto de interrogação, focagem hidrodinâmica, pressão diferencial (“flow rate”); óptica (sistema de lasers, emissão de luz - “foward scatter” (FSC) e “side scatter” (SSC) -, emissão de fluorescência – conjugar os diferentes fluorocromos, fluorescence spectra viwers, filtros; a eletrónica – detetores e processamento de sinal, como se mede, a importância da discriminação de dupletos; a digitilização e a apresentação dos resultados (histogramas, contour and density plots). Como preparar uma experiência de citometria de fluxo: a pergunta biológica, conhecer o citómetro que se usa, selecionar os reagentes (princípios e regras na escolha dos fluorocromos, a densidade antigénica, os anticorpos marcados em tandem, e preparar a amostra, controlos (biológicos, de qualidade, de coloração, de “gating”), optimização, configurar o instrumento (controlos de compensação e FMO) e a aquisição da amostra, a análise (representação dos resultados e “gating”) e estatística dos resultados (Mean e “Median fluorescence intensity” (MFI), softwares de tratamento de dados) a publicação dos resultados (Myflowcyt). Fontes úteis de consulta e estudo.
Técnicas de obtenção de organismos transgénicos
7 Outubro 2022, 09:00 • Rita Zilhão
Técnicas de obtenção de organismos transgénicos. O que é um organismo transgénico, objectivos da sua construção e suas aplicações. Como se geram animais transgénicos – a escolha do transgene, as estratégias da construção molecular e a expressão do transgene. As células alvo na construção de um transgénico. Métodos de transferência génica. A inserção aleatória, os efeitos de posição e gene targeting. Os cruzamentos necessários para a obtenção do transgene. A noção de organismo founder. Estratégias de seleção de inserção em locais específicos. Sistemas de expressão induzíveis (Tet ON/Tet OFF) e condicionais (os sistemas Cre/loxP e FLP/FRT). Modificação dirigida de genomas através de nucleases específicas e o sistema CRISPR. Confirmação da obtenção de um transgene. Transgénicos em diferentes modelos animais (ratinho, galinha, zebrafish). Preocupações éticas.
Técnicas de obtenção de organismos transgénicos
7 Outubro 2022, 08:00 • Rita Zilhão
Técnicas de obtenção de organismos transgénicos. O que é um organismo transgénico, objectivos da sua construção e suas aplicações. Como se geram animais transgénicos – a escolha do transgene, as estratégias da construção molecular e a expressão do transgene. As células alvo na construção de um transgénico. Métodos de transferência génica. A inserção aleatória, os efeitos de posição e gene targeting. Os cruzamentos necessários para a obtenção do transgene. A noção de organismo founder. Estratégias de seleção de inserção em locais específicos. Sistemas de expressão induzíveis (Tet ON/Tet OFF) e condicionais (os sistemas Cre/loxP e FLP/FRT). Modificação dirigida de genomas através de nucleases específicas e o sistema CRISPR. Confirmação da obtenção de um transgene. Transgénicos em diferentes modelos animais (ratinho, galinha, zebrafish). Preocupações éticas.