Sumários

Citometria de fluxo

24 Setembro 2018, 10:00 • Rita Zilhão

Citometria de fluxo. Definição e fundamentos da citometria de fluxo: o que é a citometria de fluxo e como medi-la. Para que serve, vantagens e os diferentes citómetros. Descrição dos componentes do citómetro de fluxo: fluídica (ponto de interrogação, focagem hidrodinâmica, pressão diferencial (“flow rate”); óptica (sistema de lasers, emissão de luz - “foward scatter” (FSC) e “side scatter” (SSC) -, emissão de fluorescência – conjugar os diferentes fluorocromos, fluorescence spectra viwers, filtros; a eletrónica – detetores e processamento de sinal, como se mede, a importância da discriminação de dupletos; a digitilização e a apresentação dos resultados (histogramas, contour and density plots). Como preparar uma experiência de citometria de fluxo: a pergunta biológica, conhecer o citómetro que se usa, selecionar os reagentes (princípios e regras na escolha dos fluorocromos, a densidade antigénica, os anticorpos marcados em tandem, e preparar a amostra, controlos (biológicos, de qualidade, de coloração, de “gating”), optimização, configurar o instrumento (controlos de compensação e FMO) e a aquisição da amostra, a análise (representação dos resultados e “gating”) e estatística dos resultados (Mean e “Median fluorescence intensity” (MFI), softwares de tratamento de dados) a publicação dos resultados (Myflowcyt). Fontes úteis de consulta e estudo.

Citometria de fluxo

24 Setembro 2018, 09:00 • Rita Zilhão

Continuação do PCR em tempo real

21 Setembro 2018, 09:00 • Rita Zilhão

Continuação do PCR em tempo real: A escolha dos controlos positivos e negativos. A escolha do controlo endógeno. Ensaios de validação, cálculo da eficiência e curvas padrão. Interpretação dos resultados de qPCR e quantificação. Planeamento de um ensaio de PCR. Métodos de quantificação – quantificação absoluta (método da curva padrão), quantificação relativa (método da curva padrão, delta delta Ct e Pfaffl). PCR qualitativo – discriminação alélica, a importância da curva de fusão (melting curve). Aplicações do qPCR.

Continuação do PCR em tempo real

21 Setembro 2018, 08:00 • Rita Zilhão

PCR em tempo real

19 Setembro 2018, 10:00 • Rita Zilhão

PCR em tempo real. Princípios do PCR em tempo real. O parâmetro de medição da fluorescência: Ct (threshold cycle). Sistemas de deteção – compostos de ligação ao DNA não específicos, sondas específicas de sequências. O fenómeno de FRET. Sondas de hidrólise (ex. Taqman), sondas estruturadas (ex. Molecular Beacon), sondas de hibridação (ex. Light Cycler). Vantagens e desvantagens dos diferentes sistemas de deteção.