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TP4: Avaliação TPs: Produção de um sistema de expressão em mamíferos para visualizar interações proteína-proteina

29 Maio 2024, 12:30 • Federico Herrera Garcia

Neste exercício final, os estudantes fizeram essencialmente o mesmo que nas TPs 2 e 3 da Sinalização Celular mas a tempo real (1 hora), com proteínas diferentes (para testar a sua habilidade para encontrar sequências online), monitorizados pelo professor, e seguindo as seguintes instruções básicas:

1. OBJETIVO: Fazer um plasmídeo bicistrónico para analisar a possível relação funcional entre as proteínas Neuronatin (NNAT) e Cortexin-2 (CTXN2), duas proteínas de função desconhecida.

2. A clonagem será feita a partir de produtos de PCR obtidos de sequências encontradas em outros plasmídeos do nosso lab, inseridos num vetor vazio pLVX utilizando enzimas de restrição. O vetor pLVX está disponível no Moodle, nos materiais das TPs.

3. Para observar a interação, iremos fusionar cada uma das proteínas de interesse com duas proteínas fluorescentes que façam FRET. Não podem ser mCherry e/ou as escolhidas nos exercícios entregues no Moodle.

4. Os dois genes de fusão devem estar separados pela sequência P2A, disponível no Moodle. A sequência P2A pode ter sido incluída num dos primers de PCR durante a amplificação de algum dos insertos.

5. CTXN2 é uma proteína pequena inserida na membrana celular, com o N-terminus na parte extracelular. A NNAT é uma proteína citosólica, solúvel.

6. As tags fluorescentes devem estar localizadas nas sequências proteicas de forma a permitir FRET se NNAT e CTXN2 interagem.

7. Finalmente, queremos testar o efeito da fosforilação do resíduo S56 da NNAT na interação das duas proteínas. Indica o primer de mutagénesis que utilizarias na própria sequência do constructo.

TP4: Avaliação TPs: Produção de um sistema de expressão em mamíferos para visualizar interações proteína-proteina

28 Maio 2024, 15:30 • Federico Herrera Garcia

Neste exercício final, os estudantes fizeram essencialmente o mesmo que que nas TPs 2 e 3 da Sinalização Celular mas a tempo real (1 hora), com proteínas diferentes (para testar a sua habilidade para encontrar sequências online), monitorizados pelo professor, e seguindo as seguintes instruções básicas:

1. OBJETIVO: Fazer um plasmídeo bicistrónico para analisar a possível interação entre as proteínas Vimentina (VIM) e TOMM6, i.e. entre o citoesqueleto de filamentos intermédios e as mitocôndrias.

2. A clonagem será feita a partir de produtos de PCR obtidos de sequências encontradas em outros plasmídeos do nosso lab, e utilizando enzimas de restrição.

3. Para observar a interação, iremos fusionar cada uma das proteínas de interesse com dois fragmentos complementares da proteína fluorescente mNeonGreen, um desde os aminoácidos 1-210 e outro do resíduo 211 até o fim da proteína fluorescente.

5. O vetor onde iremos clonar os genes quiméricos é o pcDNA 3.1+. Está disponível no Moodle, nos materiais das TPs.

6. TOMM6 é uma proteína pequena inserida na membrana externa das mitocôndrias, com o N-terminus na parte citosólica. Um dos fragmentos da proteína fluorescente deve estar ligado a este extremo.

7. A VIM pode levar uma tag nos extremos N- ou C-terminais.

8. Finalmente, queremos testar o efeito da defosforilação do resíduo na Y61 da VIM na interacção com TOMM6. Indica os primers de mutagénesis que utilizarias na própria sequência do constructo.

Transdução V: Transmissão Sináptica

28 Maio 2024, 14:00 • Federico Herrera Garcia

Esta aula foi focada na transmissão das sinais nervosas e neuromusculares, através de canais iónicos dependentes de voltagem e de ligando principalmente. Distinguiram-se sinapses químicas versus elétricas (GAP junctions) e excitadoras versus inibidoras. Explicaram-se as propriedades passivas dos neurónios e a manutenção do potencial de membrana basal, as semelhanças com circuitos elétricos e a influência do diâmetro dos axónios e do seu isolamento com mielina na condução elétrica do impulso nervoso. Explicou-se em detalhe o potencial de acção e as suas fases, de acordo com o padrão e a dinâmica de apertura de canais de diferentes tipos. Finalmente, explicaram-se os princípios de polarização dinâmica e de especificidade de conexão nos circuitos neuronais.

Utilizei o tempo restante para explicar brevemente alguns dos nossos trabalhos de investigação em sinalização celular, que ilustram a relevância destes fenómenos e ao mesmo tempo dão uma ideia do tipo de ferramentas que podemos utilizar para estuda-los. Finalizamos a aula com uma palestra de 15 min de uma investigadora convidada, Dra. Inês Ribeiro (LMU-Munich / MPI for Biological Intelligence, Alemania), uma especialista em controlo optogenético da sinalização nervosa e de comportamentos complexos em Drosophila.

Transdução IV: A via da PI3K/Akt e as RhoGTPases

27 Maio 2024, 12:00 • Federico Herrera Garcia

Estendemos a classe anterior para rever mais detalhadamente um caminho kinase muito importante com grandes diferenças em relação aos caminhos clássicos MAPK, e explicar mais detalhadamente uma subfamília particular de proteínas G conhecidas como RhoGTPases. PI3K não é uma proteína cinase, mas uma inositol-fosfato cinase, e isto deu-nos a oportunidade de recordar o importante papel dos segundos mensageiros e, em particular, dos lípidos de membrana na sinalização celular. A actividade da PI3K é contrariada pela fosfatase PTEN, que desfosforila os IPs. Ambos são relevantes para o desenvolvimento, cancro, e outros fenómenos fisiopatológicos. Descrevi as vias a jusante controladas pela PI3K via Akt. Beta-catenin, mTOR, família FoxO, família Bcl-2, e o papel contra-activo do PP2A na actividade do Akt. Os processos celulares governados por estas vias são utilizados como exemplo da sua relevância.

A parte dedicada aos RhoGTPases permite-nos

1) descrever o GDI, um elemento de sinalização característico destes GTPases versus outros membros da superfamiy Ras;

2) dar ênfase à relevância dos domínios conservados para desempenhar funções específicas; e

3) descrever CAAX, outro domínio proteico que permite o recrutamento de proteínas para a membrana quando estas são pré-niladas (um importante PTM)

TP3: Construção de um sistema FRET

22 Maio 2024, 12:30 • Federico Herrera Garcia

Na terceira TP de sinalização celular, os estudantes avançaram mais na construção de plasmídeos de expressão mais complexos, para reafirmar conceitos como a utilização dos enzimas do local de clonagem múltipla, a necessidade de manter a grelha de leitura ao longo do todo o cistrão, a necessária ausência de codões STOP dentro dos constructos, etc… Combinamos este exercício com o desenho de um par FRET para analisar as interações entre proteínas. Os estudantes produziram um sistema bicistronico FRET, no qual fusionaram duas proteínas de interesse (STAT3 e STAT1) com duas proteínas fluorescentes que eram um par FRET. Entre as duas proteínas de fusão meteram uma sequência autoclivável P2A, o que permitiria expressar as duas proteínas de fusão a partir do mesmo promotor e do mesmo plasmídeo. Os estudantes terminaram o trabalho em casa, e entregaram-o no Moodle. Aqueles que entregaram a tempo (antes da avaliação final das TPs) também receberam feedback e avaliação.