Sumários
TP3: Construção de um sistema FRET
21 Maio 2024, 15:30 • Federico Herrera Garcia
Na terceira TP de sinalização celular, os estudantes avançaram mais na construção de plasmídeos de expressão mais complexos, para reafirmar conceitos como a utilização dos enzimas do local de clonagem múltipla, a necessidade de manter a grelha de leitura ao longo do todo o cistrão, a necessária ausência de codões STOP dentro dos constructos, etc… Combinamos este exercício com o desenho de um par FRET para analisar as interações entre proteínas. Os estudantes produziram um sistema bicistronico FRET, no qual fusionaram duas proteínas de interesse (STAT3 e STAT1) com duas proteínas fluorescentes que eram um par FRET. Entre as duas proteínas de fusão meteram uma sequência autoclivável P2A, o que permitiria expressar as duas proteínas de fusão a partir do mesmo promotor e do mesmo plasmídeo. Os estudantes terminaram o trabalho em casa, e entregaram-o no Moodle. Aqueles que entregaram a tempo (antes da avaliação final das TPs) também receberam feedback e avaliação.
Transdução III: Sinalização por cinases
21 Maio 2024, 14:00 • Federico Herrera Garcia
Esta classe centrou-se nas vias de sinalização cinase, uma vez que estas são centrais para a maioria das funções celulares. Descrevemos novamente os tipos de receptores associados à cinase e os domínios proteicos que ligam os resíduos fosforilados (SH2 e PTB). Isto levou-nos a explicar a mediação das proteínas do andaime e da superfamília de Ras de GTPases entre o receptor activado e as quinases solúveis, citoplasmáticas. Descrevemos as clássicas cascatas MAPK e como a sinalização da cinase pode ser terminada. Finalizamos a aula com uma palestra de 15 min de uma investigadora convidada, Dra. Birthe Kragelund (University of Copenhagen, Dinamarca), uma especialista nas funções fisiológicas de proteínas intrinsecamente desordenadas. Falou de como alguns receptores de membrana têm um domínio intracelular desordenado que permite interações complexas com a membrana e funções relevantes para a sinalização celular.
Transdução II: Moedas de troca da sinalização celular
20 Maio 2024, 12:00 • Federico Herrera Garcia
Esta classe centrou-se numa questão central na sinalização celular: que tipos de fenómenos bioquímicos universais medeiam a transdução de sinal? Utilizámos alguns livros de texto para classificar estes fenómenos nas seguintes moedas básicas:
1.Interacções proteína-proteína: ligação a receptores, andaimes, adaptadores, complexos proteicos, homo- e heterodímeros
2.Conformação proteica
3.Actividade enzimática: pequenos cofactores de moléculas,...
4.Modificações pós-tradução (PTMs): fosforilação, acetilação, ubiquitinilação, clivagem, glicação, glicosilação,...
5.Localização subcelular: compartimentos celulares, clusters, jangadas lipídicas, amilóide, separação de fases líquido-líquido,...
6.Concentração: expressão genética/degradação de proteínas, estequiometria, acumulação, agregação, associação, hot-spots,...
7.Pequenos mediadores de sinalização: segundos mensageiros,...
Descrevemos as enzimas envolvidas nas PTMs mais comuns, o código da ubiquitina, a superfamília Ras e outras enzimas de sinalização não relacionadas com as PTMs, os diferentes tipos de domínios proteicos e a sua função e adaptadores e andaimes. Isto leva-nos à descrição de microdomínios onde proteínas específicas se podem concentrar e assim melhorar as hipóteses de interacção e a eficiência da transmissão de sinalização. Explicámos o papel do citoesqueleto, das jangadas lipídicas, da separação de fases líquido-líquido, e outras estruturas intracelulares não convencionais e microdomínios.
TP2: Mutagénese dirigida para mimetizar ou bloqueiar modificações pos-traducionais
15 Maio 2024, 12:30 • Federico Herrera Garcia
Na segunda TP de sinalização celular, os estudantes aprenderam os procedimentos para realizar uma mutagénese dirigida num plasmídeo, por médio de PCR. Aprenderam a desenhar primers de mutagénese com um programam online (PrimerX), e desenharam primers para mutar diversos resíduos da proteína STAT3 que podiam ser modificados pós-traducionalmente. Aprendimos a fazer modificações que mimetizam fosforilação ou acetilação ou que bloqueiam estas modificações sem mudar demasiado a estrutura da proteína. Este trabalho foi entregue no Moodle e os estudantes receberam feedback da qualidade dos primers. Este foi também um ponto de avaliação para as TPs.
TP2: Mutagénese dirigida para mimetizar ou bloqueiar modificações pos-traducionais
14 Maio 2024, 15:30 • Federico Herrera Garcia
Na segunda TP de sinalização celular, os estudantes aprenderam os procedimentos para realizar uma mutagénese dirigida num plasmídeo, por médio de PCR. Aprenderam a desenhar primers de mutagénese com um programam online (PrimerX), e desenharam primers para mutar diversos resíduos da proteína STAT3 que podiam ser modificados pós-traducionalmente. Aprendimos a fazer modificações que mimetizam fosforilação ou acetilação ou que bloqueiam estas modificações sem mudar demasiado a estrutura da proteína. Este trabalho foi entregue no Moodle e os estudantes receberam feedback da qualidade dos primers. Este foi também um ponto de avaliação para as TPs.