Tutorial Analise de Imagens ImageJ BEIV

25 Fevereiro 2020, 15:31 • Federico Herrera Garcia

Boa tarde, alunos- Já estão disponíveis no Moodle o protocolo para o analise de imagens da disciplina BEIV, junto com 3 imagens para vocês poderem praticar se quiserem. As imagens são originais, obtidas no nosso laboratório de precursores neurais de ratinho diferenciados a astroglia. Têm dois canais: o verde (citoesqueleto, canal 1) e o azul (nucleos, canal 2). Trata-se de utilizar o canal azul (Hoechst, nucleos) para definir a área onde queremos medir a fluorescência nos otros canais (NFkB, STAT3). Feito ao longo do tempo, podremos ter uma medida quantitativa da migração do fator de transcripção NFkB ao núcleo das células HeLa apois do estímulo com TNFalpha. Isto é algo difícil de fazer por outros métodos, e da informação relevante sobre a dinámica celular em células íntegras (ainda que mortas e fixadas neste caso). Com células vivas é igualmente possível, ainda que os métodos são diferentes. Não conseguimos utilizar anticorpos, porque são demasiado grandes para atravessar a membrana celular, e então utilizamos estratégias genéticas (transfeção com plasmidios e proteinas fluorescentes, por exemplo).

Cumprimentos,

Updated immunocytochemistry protocol and supporting information

24 Fevereiro 2020, 15:17 • Federico Herrera Garcia

Boa tarde, alunos- A pasta da parte de imunocitoquimica da Bioquimica Experimental IV já foi atualizada. O protocolo de imunocitoquimica com anticorpos de fluorescência está agora disponível, assim como a apresentação introdutoria da cadeira, uma série de links a informação de suporte online para as técnicas baseadas em anticorpos como a imunocitoquimica e o western blot.

Fica em falta o protocolo de analise de imagens pelo ImageJ, no qual ainda estou a trabalhar. Lembrem-se sff que o dia 30 de Abril (5a feira) darei uma aula extraordinaria para ajudar a analizar as imagens e preparara a figura (mas avanço que é uma aula para resolver dúvidas e ajudar in situ, e não para fazer tudo de zero).

Como foi dito na apresentação, aproveitaremos estas práticas de imunocitoquimica para analizar parámetros que ainda não foram analizados neste contexto biologico, nomeadamente a localização subcelular do fator de transcripção STAT3 em resposta ao tratamento com TNF-alpha, e a sua possível colocalização com p65. Para isso vamos deteitar o p65 com um anticorpo secundário que emite no espectro verde, e versões modificadas (phosphorylação ou acetilação) de STAT3 com um anticorpo secundário que emite no vermelho. Obviamente, os dois anticorpos primários foram feitos em espécies diferentes, ratinho (p65) e coelho (STAT3).

A ração desta incorporação é tripla:

1) reforçar o vosso conhecimento do disenho e analise de experiências com mais de um anticorpo/fluorocromo (que também serve para a cadeira de immunologia e para a técnica de citometria de fluxo, por exemplo). São muito comuns, porque dão maior informação em menos tempo.

2) incorporar um parámetro de resultado desconhecido na vossa experiência, igual que foi feito na microscopia da Bioquimica Experimental III.

3) introducir conceitos chave que serão também estudados na cadeira de sinalização celular, como as modificações post-translationais ou as interações proteina-proteina.

Com tudo, avanço que na minha availiação não conta o resultado final positivo ou negativo, senão o processo de elaboração da peça de microscopia para o artigo: preparação, aquisição e analise das amostras, e preparação da figura para o artigo.

Com os melhores cumprimentos,

Fede

Constituição dos grupos para a escrita dos artigos

19 Fevereiro 2020, 14:34 • Fernando Jose Nunes Antunes

Car@s alun@s,

Calendário

19 Fevereiro 2020, 14:28 • Fernando Jose Nunes Antunes

Car@s alun@s,

Calendário Provisório

18 Fevereiro 2020, 17:05 • Fernando Jose Nunes Antunes

Car@s alun@s,