Imunocitoquímica I: Fixação, permeabilização, bloqueio e anticorpo primario

11 Março 2020, 09:00 • Federico Herrera Garcia

Após uma breve introdução ao método de imunocitoquímica, ao protocolo e ao plano das aulas práticas, os alunos trataram as células HeLa com TNFalpha durante 15 a 120 minutos. Depois, fixaram células com metanol gelado a -20C durante 10 minutos, lavaram o excesso com PBS (3 vezes x 10 min cada) e permeabilizaram com Triton X-100 0,1% à temperatura ambiente durante 10 minutos. As amostras foram lavadas 3 vezes x 10 min cada com PBS e as amostras foram bloqueadas com Albumina de Soro Bovino a 5% durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois, os anticorpos primários contra NFkB e STAT3 foram adicionados às amostras e incubados a 4C durante a noite. Durante os tempos de incubação, expliquei mais detalhadamente os princípios subjacentes a cada etapa do protocolo, e fiz um lembrete de como e quando a etapa seguinte deveria ser levada a cabo.

Western Blot III

6 Março 2020, 09:30 • Carlos Miguel Ribeiro da Silva Farinha

Dinâmica da localização intracelular do NF-kB em células HeLa estimuladas com TNFalpha - parte III

Imunocitoquímica III: Microscopía

6 Março 2020, 08:00 • Federico Herrera Garcia

Nesta última sessão, os estudantes tiveram de adquirir imagens suficientes para efectuarem uma análise quantitativa com o software gratuito ImageJ. Foi-lhes ensinado como utilizar o software do microscópio, e os princípios por detrás do microscópio. Os objectivos, as fontes de iluminação e o próprio microscópio foram descritos em pormenor. Tiraram fotografias de cada grupo experimental até obterem entre 50 e 100 células por condição experimental. Tiraram estas imagens numa caneta para análise de imagem mais tarde.

Imunocitoquímica II: Anticorpos Secundários

5 Março 2020, 14:00 • Federico Herrera Garcia

Nesta etapa, os alunos só tinham de adicionar os anticorpos secundários às amostras e incubá-las à temperatura ambiente e na escuridão durante 2 horas. Resumidamente, os anticorpos primários foram lavados com 3 lavagens com PBS durante 10 min cada, os anticorpos secundários numa solução de BSA 1% foram adicionados às amostras e, após 2 horas, os anticorpos secundários foram lavados com PBS 3 vezes durante 10 min cada. As lamelas de vidro com as células foram então montadas em lâminas de vidro com meio de montagem, e seladas com verniz de unhas. Durante os tempos de incubação, expliquei em detalhe os princípios subjacentes a estas etapas e antecipei o trabalho que faríamos no microscópio no dia seguinte.

Western Blot II

5 Março 2020, 09:30 • Carlos Miguel Ribeiro da Silva Farinha

Dinâmica da localização intracelular do NF-kB em células HeLa estimuladas com TNFalpha - parte II