Sumários
Citometria de fluxo
23 Setembro 2024, 08:00 • Rita Zilhão
Citometria de fluxo. Definição e fundamentos da citometria de fluxo: o que é a citometria de fluxo e como medi-la. Para que serve, vantagens e os diferentes citómetros. Descrição dos componentes do citómetro de fluxo: fluídica (ponto de interrogação, focagem hidrodinâmica, pressão diferencial (“flow rate”); óptica (sistema de lasers, emissão de luz - “foward scatter” (FSC) e “side scatter” (SSC) -, emissão de fluorescência – conjugar os diferentes fluorocromos, fluorescence spectra viewers, filtros; a eletrónica – detetores e processamento de sinal, como se mede, a importância da discriminação de dupletos; a digitilização e a apresentação dos resultados (histogramas, contour and density plots). Como preparar uma experiência de citometria de fluxo: a pergunta biológica, conhecer o citómetro que se usa, selecionar os reagentes (princípios e regras na escolha dos fluorocromos, a densidade antigénica, os anticorpos marcados em tandem, e preparar a amostra, controlos (biológicos, de qualidade, de coloração, de “gating”), optimização, configurar o instrumento (controlos de compensação) e a aquisição da amostra, a análise (representação dos resultados e “gating”) e estatística dos resultados (Mean e “Median fluorescence intensity” (MFI), softwares de tratamento de dados) a publicação dos resultados (Myflowcyt). Fontes úteis de consulta e estudo. QUIZZ.
Aplicações e exemplos da citometria de fluxo na biologia molecular e celular. Avaliação do estado celular: imunofenotipagem e análise do ciclo celular. Estudos de função celular (diferenciação, proliferação, apoptose, ativação celular). Diferenciação celular: análise do estado de activação das células, identificação de antigénios de superfície e intracelulares (vias de sinalização). Proliferação: análise da divisão celular (CFSE e VP450) e análise do ciclo celular (iodeto de propídio e BRdU). Apoptose (iodeto de propídio, anexina V). Ativação celular, o ex. das plaquetas. Outros ex de aplicações: influxo de cálcio, estudo de proteínas fosforiladas (phosphoflow), secreção de citocinas (estudo de infiltrados nos tecidos do cancro da mama em resposta às terapias). Deteção intracelular de espécies reativas de oxigénio (ROX). Aplicações microbiológicas.
Tecnologias associadas à citometria de fluxo: sorteamento celular.
Microscopia de fluorescência
20 Setembro 2024, 09:00 • Rita Zilhão
Microscopia de fluorescência. Diferentes técnicas de microscopia de fluorescência. Marcação fluorescente. Características, aplicações, vantagens e desvantagens da microscopia widefield, confocal, de deconvoluntion, de iluminação estruturada (SIM), de Lattice lightsheet (LLSM). Microscopia de fluorescência por multifotões. Microscopia intravital. TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy). A evolução na resolução da microscopia de fluorescência: STORM (Stochastic optical reconstruction microscopy ) de super-resolução. Dual color STORM. Zeiss Airyscan. Aplicações: Live cell imaging, FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching), FLIP (Fluorescence Loss In Photobleaching), FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer), FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy).
Microscopia de fluorescência
20 Setembro 2024, 08:00 • Rita Zilhão
Microscopia de fluorescência. Diferentes técnicas de microscopia de fluorescência. Marcação fluorescente. Características, aplicações, vantagens e desvantagens da microscopia widefield, confocal, de deconvoluntion, de iluminação estruturada (SIM), de Lattice lightsheet (LLSM). Microscopia de fluorescência por multifotões. Microscopia intravital. TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy). A evolução na resolução da microscopia de fluorescência: STORM (Stochastic optical reconstruction microscopy ) de super-resolução. Dual color STORM. Zeiss Airyscan. Aplicações: Live cell imaging, FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching), FLIP (Fluorescence Loss In Photobleaching), FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer), FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy).
Tecnologias utilizadas no estudo do RNA
18 Setembro 2024, 09:00 • Rita Zilhão
Tecnologias utilizadas no estudo do RNA: O que é o RNA e porque é importante estudar o RNA? Ex. RNA-based therapies, RNA-based vacines. Os diferentes tipos de RNA. Como trabalhar o RNA: cuidados, extração e purificação, síntese/transcrição in vitro. Metodologias e abordagens experimentais para responder a questões biológicas específicas que envolvam moléculas de RNA: localização in vivo (Fluorescence in situ hybridization (FISH), RNA-tagging system fused to fluorescent proteins (MS2-tagged RNA; life cells) ); análise de expressão génica (Northern blot, RT-PCR, Microarrays, RNA sequencing); interação RNA-RNA e RNA-proteínas (electrophoretic mobility shift assay (EMSA), super electrophoretic mobility assay, imunoprecipitação de RNA (RIP and CLIP) e o MS2-TRAP (MS2-tagged RNA affinity purification). Um exemplo experimental: análise da função do gene CsiA de Bacillus clostridium.
Tecnologias utilizadas no estudo do RNA
18 Setembro 2024, 08:00 • Rita Zilhão
Tecnologias utilizadas no estudo do RNA: O que é o RNA e porque é importante estudar o RNA? Ex. RNA-based therapies, RNA-based vacines. Os diferentes tipos de RNA. Como trabalhar o RNA: cuidados, extração e purificação, síntese/transcrição in vitro. Metodologias e abordagens experimentais para responder a questões biológicas específicas que envolvam moléculas de RNA: localização in vivo (Fluorescence in situ hybridization (FISH), RNA-tagging system fused to fluorescent proteins (MS2-tagged RNA; life cells) ); análise de expressão génica (Northern blot, RT-PCR, Microarrays, RNA sequencing); interação RNA-RNA e RNA-proteínas (electrophoretic mobility shift assay (EMSA), super electrophoretic mobility assay, imunoprecipitação de RNA (RIP and CLIP) e o MS2-TRAP (MS2-tagged RNA affinity purification). Um exemplo experimental: análise da função do gene CsiA de Bacillus clostridium.