Frequência

18 Dezembro 2018, 14:30 • Maria Filomena Ribeiro Alcobia da Silva Trabucho Caeiro

Realização do teste correspondente à segunda frequência.

Seminário (1 aluno). Avaliação global dos resultados obtidos nas aulas laboratoriais.

17 Dezembro 2018, 17:00 • Maria Filomena Ribeiro Alcobia da Silva Trabucho Caeiro

Seminário apresentado por 1 aluno.

Apresentação e discussão dos resultados obtidos nas aulas práticas, ao longo do semestre:

·         Cálculo dos títulos dos vírus produzidos

·         Comparação dos títulos obtidos nas suspensões de vírus intra e extracelular.

·         Avaliação da qualidade e concentração do DNA e do RNA extraído de células infetadas, em cinéticas da infeção.

·         Avaliação dos DNAs genómicos dos vírus em estudo: concentração, perfis de restrição, metilação e variante do gene Vif presente.

·         Interpretação dos resultados das amplificações por PCR e RT-PCR realizadas.

·         Determinação dos tempos de infecção em que se inicia a síntese de DNA viral (avaliada por PCR às amostras de DNA extraído de culturas celulares infetadas, em diferentes tempos da infeção)

·         Determinação (avaliada por RT-PCR) dos tempos de infecção em que existem RNAs mensageiros para os diferentes produtos génicos virais (MCP, polimerase de DNA, fator de virulência Vif e proteína putativa X) em análise.

Ácidos nucleicos virais como ferramentas de variabilidade e de expressão génica (continuação)

11 Dezembro 2018, 14:30 • Maria Filomena Ribeiro Alcobia da Silva Trabucho Caeiro

Determinação do período p.i. em que se expressam os genes virais MCP, Vif, polimerase de DNA, X (codifica para uma proteína putativa):

Deteção de mRNAS específicos (RT-PCR) nas amostras de RNA extraído de células testemunho e de células infetadas, em diferentes tempos p.i.. Visualização dos resultados obtidos por eletroforese. Regiões alvo: MCP, polimerase de DNA viral, proteína putativa X, fator de virulência Vif.

Restrição enzimática dos DNAs de partículas virais:

Digestão dos DNAs extraídos de partículas virais dos seis ranavírus em estudo, com as enzimas de restrição Hind III, Pst I, Msp I e Hpa II, tendo como objetivos 1) a sua diferenciação e 2) verificar o elevado nível de metilação do DNA viral, utilizando DNA de células Vero como testemunho positivo das digestões.

Seminários (7 alunos).

10 Dezembro 2018, 17:00 • Maria Filomena Ribeiro Alcobia da Silva Trabucho Caeiro

Seminários apresentados por sete alunos.

Ácidos nucleicos virais como ferramentas de variabilidade e de expressão génica.

4 Dezembro 2018, 14:30 • Maria Filomena Ribeiro Alcobia da Silva Trabucho Caeiro

Determinação do período p.i. em que se inicia a replicação do genoma do FV3 em células Vero e avaliação do tipo de gene Vif presente nos ranavírus em estudo. 

1)     Amplificação (PCR) dos DNAs extraídos em diferentes tempos pós-infeção com MaP3, para determinar o momento da infeção em que se inicia a síntese de DNA viral, através de PCR semi-quantitativo e amplificando um fragmento do gene para a proteína principal da cápside viral.

2)     Amplificação (PCR) dos DNAs extraídos de partículas virais com primers para o gene que codifica para um fator de virulência (VIF).

Visualização dos produtos de PCR por eletroforese. 1) Observação e comparação das intensidades da banda correspondente à MCP, ao longo da infeção. 2) comparação das dimensões do amplicão correspondente ao gene Vif, e que poderá corresponder ao gene sem deleções (cerca de 1 000 pb) ou à forma truncada do gene (cerca de 200 pb).

 Tratamento com DNase I, das amostras de RNA e nova avaliação da ausência de contaminação com DNA.

Avaliação (PCR e visualização em gel de eletroforese, dos produtos de PCR) da pretendida ausência de DNA nas amostras de RNA tratadas com DNase.