Sumários
Prática 6
9 Abril 2024, 14:00 • João Picão Osório
Estudo do desenvolvimento embrionário do nemátodo C. elegans.
Preparação de embriões, larvas e adultos de C. elegans para coloração nuclear.
Observação de vermes ao microscópio de fluorescência para determinar os estádios de desenvolvimento.
Protocolo:
1. Observar as placas com C. elegans e identificar hermafroditas e machos.
2. Adicionar cerca de 2ml de PBS para a placa com vermes, agitar gentilmente a placa e transferir para um tubo de 2ml usando a micropipeta.
3. Lavar duas vezes em 1ml de x1 PBS. Para precipitar os vermes, centrifugar 1 minuto a 1000 r.p.m.
4. Fixar os vermes com 500 μl de 100% etanol frio (-20ºC) a temperatura ambiente durante 10 minutos com agitação moderada.
5. Descartar o etanol e lavar duas vezes em 1ml de x1 PBS e uma vez em um 1ml de PBTw (0.1% Tween-20 em x1 PBS).
6. Na HOTTE, colocar 200 µl do corante nuclear DAPI (5 µg/ml em PBTw; tóxico) no tubo e incubar no escuro durante 5 minutos.
7. Lavar duas vezes em um 1ml de PBTw, retirar o PBTw e adicionar 200 µl de 70% Glicerol como meio de montagem.
8. Transferir 20-50μl de vermes em meio de montagem para uma lâmina e colocar gentilmente uma lamela em cima. Selar a lamela com verniz das unhas.
Unidade de Microscopia (sala 2.1.15)
Prática 6
9 Abril 2024, 10:30 • João Picão Osório
Estudo do desenvolvimento embrionário do nemátodo C. elegans.
Preparação de embriões, larvas e adultos de C. elegans para coloração nuclear.
Observação de vermes ao microscópio de fluorescência para determinar os estádios de desenvolvimento.
Protocolo:
1. Observar as placas com C. elegans e identificar hermafroditas e machos.
2. Adicionar cerca de 2ml de PBS para a placa com vermes, agitar gentilmente a placa e transferir para um tubo de 2ml usando a micropipeta.
3. Lavar duas vezes em 1ml de x1 PBS. Para precipitar os vermes, centrifugar 1 minuto a 1000 r.p.m.
4. Fixar os vermes com 500 μl de 100% etanol frio (-20ºC) a temperatura ambiente durante 10 minutos com agitação moderada.
5. Descartar o etanol e lavar duas vezes em 1ml de x1 PBS e uma vez em um 1ml de PBTw (0.1% Tween-20 em x1 PBS).
6. Na HOTTE, colocar 200 µl do corante nuclear DAPI (5 µg/ml em PBTw; tóxico) no tubo e incubar no escuro durante 5 minutos.
7. Lavar duas vezes em um 1ml de PBTw, retirar o PBTw e adicionar 200 µl de 70% Glicerol como meio de montagem.
8. Transferir 20-50μl de vermes em meio de montagem para uma lâmina e colocar gentilmente uma lamela em cima. Selar a lamela com verniz das unhas.
Unidade de Microscopia (sala 2.1.15)
Prática 6
9 Abril 2024, 08:00 • João Picão Osório
Estudo do desenvolvimento embrionário do nemátodo C. elegans.
Preparação de embriões, larvas e adultos de C. elegans para coloração nuclear.
Observação de vermes ao microscópio de fluorescência para determinar os estádios de desenvolvimento.
Protocolo:
1. Observar as placas com C. elegans e identificar hermafroditas e machos.
2. Adicionar cerca de 2ml de PBS para a placa com vermes, agitar gentilmente a placa e transferir para um tubo de 2ml usando a micropipeta.
3. Lavar duas vezes em 1ml de x1 PBS. Para precipitar os vermes, centrifugar 1 minuto a 1000 r.p.m.
4. Fixar os vermes com 500 μl de 100% etanol frio (-20ºC) a temperatura ambiente durante 10 minutos com agitação moderada.
5. Descartar o etanol e lavar duas vezes em 1ml de x1 PBS e uma vez em um 1ml de PBTw (0.1% Tween-20 em x1 PBS).
6. Na HOTTE, colocar 200 µl do corante nuclear DAPI (5 µg/ml em PBTw; tóxico) no tubo e incubar no escuro durante 5 minutos.
7. Lavar duas vezes em um 1ml de PBTw, retirar o PBTw e adicionar 200 µl de 70% Glicerol como meio de montagem.
8. Transferir 20-50μl de vermes em meio de montagem para uma lâmina e colocar gentilmente uma lamela em cima. Selar a lamela com verniz das unhas.
Unidade de Microscopia (sala 2.1.15)
Prática 5
26 Março 2024, 17:30 • João Picão Osório
Estudo do desenvolvimento embrionário da mosca Drosophila melanogaster II.
- Observação dos resultados da imunohistoquímica num microscópio de fluorescência. Captação de imagens.
Protocolo:
montagem de embriões em laminas para microscopia
16. Retirar o PBTx e adicionar 500μl de 70% Glicerol como meio de montagem.
17. Transferir 50μl de embriões em meio de montagem para uma lâmina. Espaçar os embriões com uma agulha de dissecação ou palito e colocar gentilmente uma lamela em cima. Caso o meio de montagem não cubra toda a lamela, adicionar mais meio com uma micropipeta entre a lâmina e lamela. Selar a lamela com verniz das unhas.
Notas: As lâminas deverão ter duas tiras de fita-cola em cada lado para os embriões não serem esmagados pela lamela. É recomendável cortar a extremidade da ponta amarela para transferir os embriões.
Unidade de Microscopia (sala 2.1.15)
18. Levar as lâminas com os embriões para a Unidade de Microscopia, observa-los nos microscópios de fluorescência e fazer a aquisição
Prática 5
26 Março 2024, 14:00 • João Picão Osório
Estudo do desenvolvimento embrionário da mosca Drosophila melanogaster II.
- Observação dos resultados da imunohistoquímica num microscópio de fluorescência. Captação de imagens.
Protocolo:
montagem de embriões em laminas para microscopia
16. Retirar o PBTx e adicionar 500μl de 70% Glicerol como meio de montagem.
17. Transferir 50μl de embriões em meio de montagem para uma lâmina. Espaçar os embriões com uma agulha de dissecação ou palito e colocar gentilmente uma lamela em cima. Caso o meio de montagem não cubra toda a lamela, adicionar mais meio com uma micropipeta entre a lâmina e lamela. Selar a lamela com verniz das unhas.
Notas: As lâminas deverão ter duas tiras de fita-cola em cada lado para os embriões não serem esmagados pela lamela. É recomendável cortar a extremidade da ponta amarela para transferir os embriões.
Unidade de Microscopia (sala 2.1.15)
18. Levar as lâminas com os embriões para a Unidade de Microscopia, observa-los nos microscópios de fluorescência e fazer a aquisição