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Prática 4

19 Março 2024, 08:00 • João Picão Osório

Estudo do desenvolvimento embrionário da mosca Drosophila melanogaster I.

Preparação e observação de embriões de mosca para determinar os estádios de desenvolvimento.
Preparação de embriões para imunohistoquímica para localizar proteínas da cascata de segmentação.

Protocolo:

No lavatório (maioritariamente): colectar embriões e remoção do córion

1. Adicionar um pouco de água da torneira na placa com embriões e escovar os embriões suavemente com o pincel para ficarem em suspensão.

2. Despejar a água contendo os embriões no cesto de ovos e lavar com água destilada usando uma garrafa de esguicho para eliminar resíduos de comida. Observar os embriões à lupa.

3. Colocar o cesto com embriões em caixas de petri com lixívia para remover o córion (esta membrana torna o embrião opaco para microscopia). Incubar ~5 min com agitação suave manual e observar periodicamente os embriões à lupa para garantir que o córion foi removido pela perda dos apêndices dorsais na grande maioria dos embriões.

Nota: é altamente recomendável o uso de bata neste passo.

4. Lavar imediatamente os embriões com água usando uma garrafa de esguicho para eliminar qualquer resíduo de lixívia.

Na bancada: fixar embriões

5. Colocar o cesto contendo os embriões em papel. Transferir os embriões sem córion com o pincel para um tubo de 2ml com 500μl de 4% de formaldeído (em x1 PBS) e 500μl de n-heptano. Agitar de forma vigorosa durante 20 minutos.

6. Remover com uma pipeta o máximo possível da camada aquosa (inferior), sem retirar os embriões da interface.

7. Adicionar 500μl de metanol 100% aos embriões/heptano e agitar com força (ou com o vortex) por 1 minuto para remover a membranas vitelina. Deixar que as duas fases se separarem. Os embriões desvitelizados irão afundar no tubo.

8. Lavar três vezes em 1ml de metanol 100% e três vezes em 1ml de etanol 100% para remover quaisquer vestígios de formaldeído. Embriões podem ser armazenados em etanol a -20ºC durante semanas/meses.

Imunohistoquímica

9. Lavar três vezes rápidas e quatro longas de 10 minutos em 1ml de PBTx (0.3% Triton-X em x1 PBS).

10. Em tubos distintos, adicionar 100μl de um anticorpo primário diluído 1:20 em PBTx. Os anticorpos foram gerados em ratinho. Anticorpos: α-Eve (even-skipped), α-En (engrailed), α-Ubx (Ultrabithorax) e α-Repo (reversed polarity).

11. Incubar 12-24h a 4ºC em agitação muito ligeira.

Prática 3

12 Março 2024, 17:30 • João Picão Osório

Análise de processos moleculares no controlo do desenvolvimento embrionário: explorando os mecanismos que controlam a expressão do gene ‘pair-rule’ fushi-tarazu (ftz) em Drosophila melanogaster.

Objectivo: Interpretação de resultados científicos para fomentar a discussão e raciocínio científicos em conceitos basilares de biologia do desenvolvimento