Sumários
Prática 5
26 Março 2024, 10:30 • João Picão Osório
Estudo do desenvolvimento embrionário da mosca Drosophila melanogaster II.
- Observação dos resultados da imunohistoquímica num microscópio de fluorescência. Captação de imagens.
Protocolo:
montagem de embriões em laminas para microscopia
16. Retirar o PBTx e adicionar 500μl de 70% Glicerol como meio de montagem.
17. Transferir 50μl de embriões em meio de montagem para uma lâmina. Espaçar os embriões com uma agulha de dissecação ou palito e colocar gentilmente uma lamela em cima. Caso o meio de montagem não cubra toda a lamela, adicionar mais meio com uma micropipeta entre a lâmina e lamela. Selar a lamela com verniz das unhas.
Notas: As lâminas deverão ter duas tiras de fita-cola em cada lado para os embriões não serem esmagados pela lamela. É recomendável cortar a extremidade da ponta amarela para transferir os embriões.
Unidade de Microscopia (sala 2.1.15)
18. Levar as lâminas com os embriões para a Unidade de Microscopia, observa-los nos microscópios de fluorescência e fazer a aquisição
Prática 5
26 Março 2024, 08:00 • João Picão Osório
Estudo do desenvolvimento embrionário da mosca Drosophila melanogaster II.
- Observação dos resultados da imunohistoquímica num microscópio de fluorescência. Captação de imagens.
Protocolo:
montagem de embriões em laminas para microscopia
16. Retirar o PBTx e adicionar 500μl de 70% Glicerol como meio de montagem.
17. Transferir 50μl de embriões em meio de montagem para uma lâmina. Espaçar os embriões com uma agulha de dissecação ou palito e colocar gentilmente uma lamela em cima. Caso o meio de montagem não cubra toda a lamela, adicionar mais meio com uma micropipeta entre a lâmina e lamela. Selar a lamela com verniz das unhas.
Notas: As lâminas deverão ter duas tiras de fita-cola em cada lado para os embriões não serem esmagados pela lamela. É recomendável cortar a extremidade da ponta amarela para transferir os embriões.
Unidade de Microscopia (sala 2.1.15)
18. Levar as lâminas com os embriões para a Unidade de Microscopia, observa-los nos microscópios de fluorescência e fazer a aquisição
Prática 4
19 Março 2024, 17:30 • João Picão Osório
Estudo do desenvolvimento embrionário da mosca Drosophila melanogaster I.
- Preparação e observação de embriões de mosca para determinar os estádios de desenvolvimento.
- Preparação de embriões para imunohistoquímica para localizar proteínas da cascata de segmentação.
Protocolo:
No lavatório (maioritariamente): colectar embriões e remoção do córion
1. Adicionar um pouco de água da torneira na placa com embriões e escovar os embriões suavemente com o pincel para ficarem em suspensão.
2. Despejar a água contendo os embriões no cesto de ovos e lavar com água destilada usando uma garrafa de esguicho para eliminar resíduos de comida. Observar os embriões à lupa.
3. Colocar o cesto com embriões em caixas de petri com lixívia para remover o córion (esta membrana torna o embrião opaco para microscopia). Incubar ~5 min com agitação suave manual e observar periodicamente os embriões à lupa para garantir que o córion foi removido pela perda dos apêndices dorsais na grande maioria dos embriões.
Nota: é altamente recomendável o uso de bata neste passo.
4. Lavar imediatamente os embriões com água usando uma garrafa de esguicho para eliminar qualquer resíduo de lixívia.
Na bancada: fixar embriões
5. Colocar o cesto contendo os embriões em papel. Transferir os embriões sem córion com o pincel para um tubo de 2ml com 500μl de 4% de formaldeído (em x1 PBS) e 500μl de n-heptano. Agitar de forma vigorosa durante 20 minutos.
6. Remover com uma pipeta o máximo possível da camada aquosa (inferior), sem retirar os embriões da interface.
7. Adicionar 500μl de metanol 100% aos embriões/heptano e agitar com força (ou com o vortex) por 1 minuto para remover a membranas vitelina. Deixar que as duas fases se separarem. Os embriões desvitelizados irão afundar no tubo.
8. Lavar três vezes em 1ml de metanol 100% e três vezes em 1ml de etanol 100% para remover quaisquer vestígios de formaldeído. Embriões podem ser armazenados em etanol a -20ºC durante semanas/meses.
Imunohistoquímica
9. Lavar três vezes rápidas e quatro longas de 10 minutos em 1ml de PBTx (0.3% Triton-X em x1 PBS).
10. Em tubos distintos, adicionar 100μl de um anticorpo primário diluído 1:20 em PBTx. Os anticorpos foram gerados em ratinho. Anticorpos: α-Eve (even-skipped), α-En (engrailed), α-Ubx (Ultrabithorax) e α-Repo (reversed polarity).
11. Incubar 12-24h a 4ºC em agitação muito ligeira.
Prática 4
19 Março 2024, 14:00 • João Picão Osório
Estudo do desenvolvimento embrionário da mosca Drosophila melanogaster I.
- Preparação e observação de embriões de mosca para determinar os estádios de desenvolvimento.
- Preparação de embriões para imunohistoquímica para localizar proteínas da cascata de segmentação.
Protocolo:
No lavatório (maioritariamente): colectar embriões e remoção do córion
1. Adicionar um pouco de água da torneira na placa com embriões e escovar os embriões suavemente com o pincel para ficarem em suspensão.
2. Despejar a água contendo os embriões no cesto de ovos e lavar com água destilada usando uma garrafa de esguicho para eliminar resíduos de comida. Observar os embriões à lupa.
3. Colocar o cesto com embriões em caixas de petri com lixívia para remover o córion (esta membrana torna o embrião opaco para microscopia). Incubar ~5 min com agitação suave manual e observar periodicamente os embriões à lupa para garantir que o córion foi removido pela perda dos apêndices dorsais na grande maioria dos embriões.
Nota: é altamente recomendável o uso de bata neste passo.
4. Lavar imediatamente os embriões com água usando uma garrafa de esguicho para eliminar qualquer resíduo de lixívia.
Na bancada: fixar embriões
5. Colocar o cesto contendo os embriões em papel. Transferir os embriões sem córion com o pincel para um tubo de 2ml com 500μl de 4% de formaldeído (em x1 PBS) e 500μl de n-heptano. Agitar de forma vigorosa durante 20 minutos.
6. Remover com uma pipeta o máximo possível da camada aquosa (inferior), sem retirar os embriões da interface.
7. Adicionar 500μl de metanol 100% aos embriões/heptano e agitar com força (ou com o vortex) por 1 minuto para remover a membranas vitelina. Deixar que as duas fases se separarem. Os embriões desvitelizados irão afundar no tubo.
8. Lavar três vezes em 1ml de metanol 100% e três vezes em 1ml de etanol 100% para remover quaisquer vestígios de formaldeído. Embriões podem ser armazenados em etanol a -20ºC durante semanas/meses.
Imunohistoquímica
9. Lavar três vezes rápidas e quatro longas de 10 minutos em 1ml de PBTx (0.3% Triton-X em x1 PBS).
10. Em tubos distintos, adicionar 100μl de um anticorpo primário diluído 1:20 em PBTx. Os anticorpos foram gerados em ratinho. Anticorpos: α-Eve (even-skipped), α-En (engrailed), α-Ubx (Ultrabithorax) e α-Repo (reversed polarity).
11. Incubar 12-24h a 4ºC em agitação muito ligeira.
Prática 4
19 Março 2024, 10:30 • João Picão Osório
Estudo do desenvolvimento embrionário da mosca Drosophila melanogaster I.
- Preparação e observação de embriões de mosca para determinar os estádios de desenvolvimento.
- Preparação de embriões para imunohistoquímica para localizar proteínas da cascata de segmentação.
Protocolo:
No lavatório (maioritariamente): colectar embriões e remoção do córion
1. Adicionar um pouco de água da torneira na placa com embriões e escovar os embriões suavemente com o pincel para ficarem em suspensão.
2. Despejar a água contendo os embriões no cesto de ovos e lavar com água destilada usando uma garrafa de esguicho para eliminar resíduos de comida. Observar os embriões à lupa.
3. Colocar o cesto com embriões em caixas de petri com lixívia para remover o córion (esta membrana torna o embrião opaco para microscopia). Incubar ~5 min com agitação suave manual e observar periodicamente os embriões à lupa para garantir que o córion foi removido pela perda dos apêndices dorsais na grande maioria dos embriões.
Nota: é altamente recomendável o uso de bata neste passo.
4. Lavar imediatamente os embriões com água usando uma garrafa de esguicho para eliminar qualquer resíduo de lixívia.
Na bancada: fixar embriões
5. Colocar o cesto contendo os embriões em papel. Transferir os embriões sem córion com o pincel para um tubo de 2ml com 500μl de 4% de formaldeído (em x1 PBS) e 500μl de n-heptano. Agitar de forma vigorosa durante 20 minutos.
6. Remover com uma pipeta o máximo possível da camada aquosa (inferior), sem retirar os embriões da interface.
7. Adicionar 500μl de metanol 100% aos embriões/heptano e agitar com força (ou com o vortex) por 1 minuto para remover a membranas vitelina. Deixar que as duas fases se separarem. Os embriões desvitelizados irão afundar no tubo.
8. Lavar três vezes em 1ml de metanol 100% e três vezes em 1ml de etanol 100% para remover quaisquer vestígios de formaldeído. Embriões podem ser armazenados em etanol a -20ºC durante semanas/meses.
Imunohistoquímica
9. Lavar três vezes rápidas e quatro longas de 10 minutos em 1ml de PBTx (0.3% Triton-X em x1 PBS).
10. Em tubos distintos, adicionar 100μl de um anticorpo primário diluído 1:20 em PBTx. Os anticorpos foram gerados em ratinho. Anticorpos: α-Eve (even-skipped), α-En (engrailed), α-Ubx (Ultrabithorax) e α-Repo (reversed polarity).
11. Incubar 12-24h a 4ºC em agitação muito ligeira.