Sumários
Preparação de meios
27 Setembro 2019, 08:00 • Marta Sousa Silva
Preparação de meios e crescimento das células de levedura
Preparação de meios
26 Setembro 2019, 14:00 • Marta Sousa Silva
Preparação de meios e crescimento das células de levedura
Preparação de meios
26 Setembro 2019, 08:00 • Marta Sousa Silva
Preparação de meios e crescimento das células de levedura
Apresentação. Análise informático de imagens de fluorescência obtidas de amostras de leveduras vivas
19 Setembro 2019, 14:00 • Federico Herrera Garcia
Estrutura, justificação e princípios para as aulas práticas de microscopia. Desenhamos uma célula de levedura e os seus componentes: núcleo, vacúolo, mitocôndria, membrana celular, parede celular, botão de fissão. As mitocôndrias também foram identificadas como a principal fonte de espécies reativas de oxigênio (ERO). Explicamos quais colorações usaríamos para visualizar o núcleo (Hoechst) e a parede (branco de calcofluor) e quantificar o número de células vivas e mortas (Live-or-dye), a quantidade de ROS (DCFHDA) ou a mitocôndria atividade (123-rodamina) nas células vivas. Explicamos que faríamos colorações duplas, usando dois fluorocromos compatíveis simultaneamente, um emitindo no espectro azul (Hoechst ou calcofluor white) e outro no espectro verde (DCFHDA ou 123-rodamina), com exceção do Live-or-Dye, que emite no espectro vermelho. Os princípios desses ensaios e os conceitos de espectroscopia de imagem e excitação e emissão de fluorescência foram explicados brevemente, e alguns documentos técnicos adicionais foram enviados via Moodle para ilustrar essas explicações. O Hoechst se liga a ácidos nucleicos, com alguma preferência pelo DNA, e é permeável, tornando-o a escolha certa para a geração de imagens de núcleos celulares em células vivas. Uma coloração semelhante, DAPI, não é tão permeável e, portanto, é mais frequentemente usada para células fixadas. As diferenças entre trabalhar com células fixadas ou vivas também foram explicadas neste ponto. O calcofluor white liga-se aos açúcares na parede celular. O Live-or-Dye é impermeável e, portanto, só entra nas células mortas onde a membrana está danificada. O DCFHDA é permeável e metabolizado pelas esterasas quando entra nas células, liberando o DCFH, que por sua vez reage com as ROS e emite fluorescência no processo. A fluorescência de 123-rodamina colora as mitocôndrias ativas, embora o fluoróforo se difunda no citoplasma, e sua fluorescência é proporcional à atividade mitocondrial.
Também explicamos novamente o desenho experimental: comparando os parâmetros morfológicos e funcionais em uma cepa de levedura de controle versus uma cepa em que o gene Glo1 foi deleçonado. Como o Glo1 está envolvido na detoxificação do metilglioxal durante o estresse induzido pela glicação, hipotetizamos que as células mutantes deficientes em Glo1 podem ter um nível mais alto de estresse basal, disfunção mitocondrial, menor viabilidade ou alterações morfológicas imprevisíveis. No entanto, os estudantes foram alertados repetidamente que não devemos assumir que essas ou outras mudanças necessariamente aconteceriam, pois os organismos vivos têm mecanismos de adaptação que não entendemos completamente e estamos apenas removendo um gene. O objetivo foi fazer uma descrição das alterações morfológicas e funcionais observadas nas cepas mutantes versus controle, se houver.
Para atingir esse objetivo, capturamos imagens de células de levedura vivas coloradas usando um microscópio de fluorescência wide field com uma objetiva de óleo 63X e uma câmera de alta resolução, e analisamos as imagens com um software livre amplamente utilizado na comunidade de microscopia, denominado FIJI ou ImageJ. Os alunos instalaram esse programa nos seus computadores e aprenderam: 1) como abrir e processar uma imagem para análises morfológicas e quantitativas; 2) como analisar a morfologia das células e organelas; 3) como quantificar a intensidade de fluorescência de células e organelas; 4) como preparar uma imagem representativa, incluindo uma barra de escala e mudando as cores da imagem para atingir uma maior qualidade. Os procedimentos e outros detalhes técnicos foram definidos em vários documentos enviados para o Moodle e Fenix antes das aulas e estavam disponíveis ao longo do semestre. Esses documentos foram atualizados e refinados quando os alunos se familiarizaram com os procedimentos e começaram a fazer perguntas relevantes. Além disso, alguns estudantes identificaram alguns erros nos protocolos originais, e isso permitiu que eles tivessem um protocolo muito rigoroso no momento em que precisavam preparar seu relatório.
No final da aula, os alunos devem ter uma idéia clara das etapas básicas a serem seguidas para geração de imagens de células vivas e obter controle suficiente do software de análise de imagem para produzir resultados prontos para publicação, de alta qualidade.
Os alunos foram divididos em 3-4 grupos, e cada grupo corava células de levedura com uma combinação diferente de colorações. Grupo 1, Hoechst e 123-Rodamina; Grupo 2, Hoechst e DCFHDA; Grupo 3, Calcofluor branco e Live-or-dye; Grupo 4, Calcofluor branco e DCFHDA. Os grupos 1 e 2 continuariam com a preparação da amostra e a aquisição de imagens à tarde, enquanto os grupos 3 e 4 o fariam na manhã de sexta-feira (dia seguinte).