Sumários
Cinética enzimática, parte 2
17 Outubro 2019, 14:00 • António Eduardo do Nascimento Ferreira
Discussão de resultados da atividade de glioxalase I de levedura: cálculo das velocidades iniciais, variação com a concentração de extrato, comparação das estirpes
wild type e Δ GLO1, variação com o substrato, cálculo de Km, V e atividade específica.
PCR 2
17 Outubro 2019, 08:00 • Margarida Henriques da Gama Carvalho
PCR - parte II: eletroforese em gel de agarose, aquisição de imagens e análise de resultados
Cinética enzimática, parte 1
11 Outubro 2019, 08:00 • António Eduardo do Nascimento Ferreira
Ensaios de atividade enzimática de glioxalase I de levedura: preparação de soluções, preparação de extrato enzimático, medições de atividade por espectrofotometria de UV variando a concentração de extrato e concentração de substrato. Estimação de da concentração de proteína pelo método de Warburg-Christian.
Microscopia 1: Captura de imagens de leveduras vivas com microscopia de fluorescência (Grupos 1 e 2)
10 Outubro 2019, 14:00 • Federico Herrera Garcia
O Grupo 1 pegou em 2 ml de culturas frescas de cepas de levedura controlo e mutantes, sedimentou as células, lavou-as com 1 ml de PBS e adicionou as colorações correspondentes. As células foram incubadas com as colorações no escuro e agitadas por 20 min. Durante esta incubação, foi explicado todo o procedimento para a preparação das amostras e a aquisição das imagens. As células foram então centrifugadas para remover o excesso de coloração e interromper a reação, lavadas 3 vezes com 1 ml de PBS e ressuspensas em 50 µl de PBS e 50 µl de glicerol para aumentar a viscosidade das amostras e evitar microcorrentes e movimento de leveduras / vibração durante a aquisição das imagens. Dez µl desta amostra concentrada foram colocados em uma lâmina de microscópio, montados com uma lamela de 1,5 de espessura e pressionados para colocar todas as células no mesmo plano focal. Alguns estudantes acharam isso complicado, pois muita pressão quebraria as células e muito pouco produziria artefatos devido a células em planos focais próximos, mas diferentes. Os procedimentos para trabalhar com o microscópio foram então explicados, e os alunos adicionaram uma gota de óleo de imersão ao objetivo 63X, colocaram a amostra em cima e localizaram as células no plano focal direito. Uma vez lá, explicamos novamente a estrutura e as partes de uma célula de levedura, desta vez com exemplos reais, e lembramos aos alunos os objetivos da prática: comparar a morfologia e a função das cepas de controlo e mutantes e preparar uma imagem representativa da microscopia para publicação. Os alunos tiraram pelo menos 10 imagens em 10 campos diferentes para cada grupo experimental, adquirindo os 2 espectros correspondentes (azul / verde ou azul / vermelho) mais a luz transmitida para ter uma idéia da forma da levedura. Eles foram avisados de que, às vezes, as fotos que parecem boas quando são tiradas no microscópio podem ser muito difíceis de analisar no computador e, portanto, os estudantes devem tirar o máximo de fotos possível para ter material de trabalho suficiente. Alguns alunos confessaram mais tarde que não prestaram atenção suficiente a esse aviso, e os seus relatórios tiveram uma qualidade inferior devido a dificuldades de análise.
Enquanto o grupo 1 adquiria suas fotos sob a supervisão de um técnico dedicado, encontramos o grupo 2 para iniciar a preparação de suas amostras. Os mesmos procedimentos descritos acima foram seguidos.