PCR 2

5 Dezembro 2019, 08:00 • Margarida Henriques da Gama Carvalho

PCR - parte II: eletroforese em gel de agarose, aquisição de imagens e análise de resultados

Microscopia 2: Captura de imagens de leveduras vivas com microscopia de fluorescência (Grupos 3 e 4)

29 Novembro 2019, 08:00 • Federico Herrera Garcia

O Grupo 3 pegou em 2 ml de culturas frescas de cepas de levedura controlo e mutantes, sedimentou as células, lavou-as com 1 ml de PBS e adicionou as colorações correspondentes. As células foram incubadas com as colorações no escuro e agitadas por 20 min. Durante esta incubação, foi explicado todo o procedimento para a preparação das amostras e a aquisição das imagens. As células foram então centrifugadas para remover o excesso de coloração e interromper a reação, lavadas 3 vezes com 1 ml de PBS e ressuspensas em 50 µl de PBS e 50 µl de glicerol para aumentar a viscosidade das amostras e evitar microcorrentes e movimento de leveduras / vibração durante a aquisição das imagens. Dez µl desta amostra concentrada foram colocados em uma lâmina de microscópio, montados com uma lamela de 1,5 de espessura e pressionados para colocar todas as células no mesmo plano focal. Alguns estudantes acharam isso complicado, pois muita pressão quebraria as células e muito pouco produziria artefatos devido a células em planos focais próximos, mas diferentes. Os procedimentos para trabalhar com o microscópio foram então explicados, e os alunos adicionaram uma gota de óleo de imersão ao objetivo 63X, colocaram a amostra em cima e localizaram as células no plano focal direito. Uma vez lá, explicamos novamente a estrutura e as partes de uma célula de levedura, desta vez com exemplos reais, e lembramos aos alunos os objetivos da prática: comparar a morfologia e a função das cepas de controlo e mutantes e preparar uma imagem representativa da microscopia para publicação. Os alunos tiraram pelo menos 10 imagens em 10 campos diferentes para cada grupo experimental, adquirindo os 2 espectros correspondentes (azul / verde ou azul / vermelho) mais a luz transmitida para ter uma idéia da forma da levedura. Eles foram avisados ​​de que, às vezes, as fotos que parecem boas quando são tiradas no microscópio podem ser muito difíceis de analisar no computador e, portanto, os estudantes devem tirar o máximo de fotos possível para ter material de trabalho suficiente. Alguns alunos confessaram mais tarde que não prestaram atenção suficiente a esse aviso, e os seus relatórios tiveram uma qualidade inferior devido a dificuldades de análise.

Enquanto o grupo 3 adquiria suas fotos sob a supervisão de um técnico dedicado, encontramos o grupo 4 para iniciar a preparação de suas amostras. Os mesmos procedimentos descritos acima foram seguidos.

Microscopia 2: Captura de imagens de leveduras vivas com microscopia de fluorescência (Grupos 3 e 4)

28 Novembro 2019, 14:00 • Federico Herrera Garcia

O Grupo 3 pegou em 2 ml de culturas frescas de cepas de levedura controlo e mutantes, sedimentou as células, lavou-as com 1 ml de PBS e adicionou as colorações correspondentes. As células foram incubadas com as colorações no escuro e agitadas por 20 min. Durante esta incubação, foi explicado todo o procedimento para a preparação das amostras e a aquisição das imagens. As células foram então centrifugadas para remover o excesso de coloração e interromper a reação, lavadas 3 vezes com 1 ml de PBS e ressuspensas em 50 µl de PBS e 50 µl de glicerol para aumentar a viscosidade das amostras e evitar microcorrentes e movimento de leveduras / vibração durante a aquisição das imagens. Dez µl desta amostra concentrada foram colocados em uma lâmina de microscópio, montados com uma lamela de 1,5 de espessura e pressionados para colocar todas as células no mesmo plano focal. Alguns estudantes acharam isso complicado, pois muita pressão quebraria as células e muito pouco produziria artefatos devido a células em planos focais próximos, mas diferentes. Os procedimentos para trabalhar com o microscópio foram então explicados, e os alunos adicionaram uma gota de óleo de imersão ao objetivo 63X, colocaram a amostra em cima e localizaram as células no plano focal direito. Uma vez lá, explicamos novamente a estrutura e as partes de uma célula de levedura, desta vez com exemplos reais, e lembramos aos alunos os objetivos da prática: comparar a morfologia e a função das cepas de controlo e mutantes e preparar uma imagem representativa da microscopia para publicação. Os alunos tiraram pelo menos 10 imagens em 10 campos diferentes para cada grupo experimental, adquirindo os 2 espectros correspondentes (azul / verde ou azul / vermelho) mais a luz transmitida para ter uma idéia da forma da levedura. Eles foram avisados ​​de que, às vezes, as fotos que parecem boas quando são tiradas no microscópio podem ser muito difíceis de analisar no computador e, portanto, os estudantes devem tirar o máximo de fotos possível para ter material de trabalho suficiente. Alguns alunos confessaram mais tarde que não prestaram atenção suficiente a esse aviso, e os seus relatórios tiveram uma qualidade inferior devido a dificuldades de análise.

Enquanto o grupo 3 adquiria suas fotos sob a supervisão de um técnico dedicado, encontramos o grupo 4 para iniciar a preparação de suas amostras. Os mesmos procedimentos descritos acima foram seguidos.

Cinética enzimática, parte 1

28 Novembro 2019, 14:00 • António Eduardo do Nascimento Ferreira

Ensaios de atividade enzimática de glioxalase I de levedura: preparação de soluções, preparação de extrato enzimático, medições de atividade por espectrofotometria de  UV variando a concentração de extrato e concentração de substrato. Estimação de da concentração de proteína pelo método de Warburg-Christian.

Microscopia 1: Captura de imagens de leveduras vivas com microscopia de fluorescência (Grupos 1 e 2)

28 Novembro 2019, 08:00 • Federico Herrera Garcia

O Grupo 1 pegou em 2 ml de culturas frescas de cepas de levedura controlo e mutantes, sedimentou as células, lavou-as com 1 ml de PBS e adicionou as colorações correspondentes. As células foram incubadas com as colorações no escuro e agitadas por 20 min. Durante esta incubação, foi explicado todo o procedimento para a preparação das amostras e a aquisição das imagens. As células foram então centrifugadas para remover o excesso de coloração e interromper a reação, lavadas 3 vezes com 1 ml de PBS e ressuspensas em 50 µl de PBS e 50 µl de glicerol para aumentar a viscosidade das amostras e evitar microcorrentes e movimento de leveduras / vibração durante a aquisição das imagens. Dez µl desta amostra concentrada foram colocados em uma lâmina de microscópio, montados com uma lamela de 1,5 de espessura e pressionados para colocar todas as células no mesmo plano focal. Alguns estudantes acharam isso complicado, pois muita pressão quebraria as células e muito pouco produziria artefatos devido a células em planos focais próximos, mas diferentes. Os procedimentos para trabalhar com o microscópio foram então explicados, e os alunos adicionaram uma gota de óleo de imersão ao objetivo 63X, colocaram a amostra em cima e localizaram as células no plano focal direito. Uma vez lá, explicamos novamente a estrutura e as partes de uma célula de levedura, desta vez com exemplos reais, e lembramos aos alunos os objetivos da prática: comparar a morfologia e a função das cepas de controlo e mutantes e preparar uma imagem representativa da microscopia para publicação. Os alunos tiraram pelo menos 10 imagens em 10 campos diferentes para cada grupo experimental, adquirindo os 2 espectros correspondentes (azul / verde ou azul / vermelho) mais a luz transmitida para ter uma idéia da forma da levedura. Eles foram avisados ​​de que, às vezes, as fotos que parecem boas quando são tiradas no microscópio podem ser muito difíceis de analisar no computador e, portanto, os estudantes devem tirar o máximo de fotos possível para ter material de trabalho suficiente. Alguns alunos confessaram mais tarde que não prestaram atenção suficiente a esse aviso, e os seus relatórios tiveram uma qualidade inferior devido a dificuldades de análise.

Enquanto o grupo 1 adquiria suas fotos sob a supervisão de um técnico dedicado, encontramos o grupo 2 para iniciar a preparação de suas amostras. Os mesmos procedimentos descritos acima foram seguidos.