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Desenho experimental e construção de ferramentas moleculares (DEFM)

20 Fevereiro 2026, 14:00 • Federico Herrera Garcia

A aula abordou o desenho experimental e a construção de ferramentas moleculares para estudar proteínas em células de mamífero. O exemplo inicial foi a proteína STAT3, em que se pretende introduzir versões mutadas em células HeLa sem STAT3 endógeno, visualizar essas versões por fusão com uma proteína fluorescente e estudar o efeito de modificações pós-traducionais específicas.

1. Construção de plasmídeos de expressão em mamíferos

O primeiro grande tema foi a geração de um plasmídeo para expressar uma proteína de fusão Brawnin-mCherry em células de mamífero.

O objectivo é fusionar a proteína mitocondrial Brawnin, também chamada UQCC6, com a proteína fluorescente mCherry, de modo a visualizar Brawnin em células vivas. Como as duas proteínas ficam ligadas de forma irreversível, a fluorescência vermelha da mCherry indica a localização de Brawnin.

O vector usado é o pcDNA3.1(-), um plasmídeo de expressão em mamíferos. Foram discutidos os seus elementos principais:

  • MCS, ou local de clonagem múltipla: zona onde se inserem as sequências de interesse.
  • Promotor CMV: promove uma expressão forte e constitutiva em células de mamífero.
  • Sinal de poliadenilação: permite a adição da cauda polyA ao mRNA.
  • Origem de replicação bacteriana: permite a multiplicação do plasmídeo em bactérias, normalmente E. coli.
  • Genes de resistência a antibióticos:
    • Ampicilina, para seleccionar bactérias transformadas.
    • Higromicina, para seleccionar células de mamífero transfectadas.

Também foi introduzido o programa ApE, usado para visualizar mapas de plasmídeos, identificar “features” e localizar locais únicos de restrição.

2. Escolha e obtenção das sequências de interesse

A aula explicou como obter sequências fiáveis para clonagem.

Para Brawnin/UQCC6, a sequência da proteína humana é procurada no UniProt, mas como é necessário trabalhar com DNA, recorre-se depois à base de dados CCDS, que fornece a sequência codificante consenso em nucleótidos.

Para mCherry, como não é uma proteína natural mas sim uma proteína fluorescente derivada de DsRed, foi sugerido o uso da FPbase. A partir daí, pode-se aceder à sequência em UniProt e depois ao GenBank para obter a sequência codificante em nucleótidos.

Foi sublinhada a importância de confirmar:

  • se a sequência começa com ATG, o codão de iniciação;
  • se termina com um codão STOP, como TAA, TAG ou TGA;
  • se a sequência está no sentido correcto ou em reverse complement;
  • se a tradução da sequência de DNA corresponde à sequência proteica esperada.

3. Estratégia de clonagem da proteína de fusão Brawnin-mCherry

A construção desejada é uma fusão Brawnin-mCherry, nesta ordem. Isso significa que a mCherry ficará ligada ao extremo C-terminal da Brawnin.

A clonagem tradicional envolve amplificar as sequências por PCR, mas os primers são desenhados com “caudas” adicionais contendo locais de reconhecimento para enzimas de restrição. Assim, os produtos de PCR podem ser digeridos e inseridos no plasmídeo nos locais correctos.

Foram explicadas várias regras importantes:

  • As duas sequências devem ser inseridas no MCS.
  • A primeira sequência, Brawnin, não deve ter codão STOP, caso contrário a tradução terminaria antes da mCherry.
  • A segunda sequência, mCherry, deve ter o seu codão STOP.
  • Qualquer sequência entre Brawnin e mCherry será traduzida como parte da proteína final.
  • Essa sequência intermédia deve manter a grelha de leitura, ou seja, deve ter um número de nucleótidos múltiplo de 3.
  • As enzimas de restrição escolhidas devem cortar apenas uma vez no plasmídeo e não devem cortar dentro das sequências Brawnin ou mCherry.
  • Usar duas enzimas diferentes permite clonagem direccional, reduzindo o risco de o fragmento entrar invertido.
  • Extremos coesivos aumentam a eficiência e especificidade da ligação em comparação com extremos rombos.

4. Mutagénese dirigida e estudo de modificações pós-traducionais

O segundo grande tema foi a mutagénese dirigida, usada para estudar o papel de modificações pós-traducionais em proteínas.

Foram dados exemplos com STAT3, uma proteína regulada por fosforilação e acetilação:

  • A fosforilação em Y705 promove a retenção nuclear e activação transcricional.
  • A acetilação em K685 e a fosforilação em S727 podem modular a actividade transcricional.
  • A fosforilação em S701 também pode ser relevante em algumas isoformas.

Depois, os exercícios aplicaram estes conceitos à proteína Brawnin, focando três resíduos:

  • S65, uma serina potencialmente fosforilável.
  • Y10, uma tirosina potencialmente fosforilável.
  • K49, uma lisina potencialmente acetilável ou modificável de outras formas.

A ideia é substituir aminoácidos modificáveis por outros que:

  • não possam ser modificados;
  • imitem, tanto quanto possível, o estado modificado.

Exemplos típicos:

  • Serina ou treonina fosforilável podem ser substituídas por alanina para impedir fosforilação.
  • Serina ou treonina fosforilada pode ser parcialmente mimetizada por aspartato ou glutamato, por terem carga negativa.
  • Tirosina pode ser substituída por fenilalanina para impedir fosforilação, mantendo uma estrutura aromática semelhante.
  • Lisina pode ser substituída por arginina para manter carga positiva e impedir acetilação, ou por glutamina para imitar parcialmente uma lisina acetilada.

5. Como funciona a mutagénese dirigida

A mutagénese dirigida tradicional é feita por PCR usando o plasmídeo original como molde. Os primers contêm a mutação desejada no meio e regiões complementares longas nos lados, normalmente cerca de 15 a 20 nucleótidos de cada lado.

O procedimento geral inclui:

  1. Desenho de primers contendo a mutação.
  2. PCR para amplificar o plasmídeo completo.
  3. Digestão com DpnI.
  4. Transformação em E. coli.
  5. Extracção do DNA plasmídico.
  6. Sequenciação para confirmar que a mutação foi introduzida correctamente.

O papel da DpnI é degradar o plasmídeo parental metilado, que veio de bactérias, deixando preferencialmente o DNA recém-sintetizado pela PCR, que contém a mutação.

Foi também apresentado o uso da ferramenta online PrimerX para desenhar primers de mutagénese. A sequência inserida deve incluir apenas uma região suficiente em torno da mutação, com mais de 30 a 40 nucleótidos de cada lado, e não necessariamente o plasmídeo inteiro.

6. Ferramentas CRISPR/Cas9

A terceira parte da aula focou a geração de uma ferramenta CRISPR/Cas9 para produzir knock-outs.

No sistema natural bacteriano, o CRISPR/Cas funciona como uma forma de imunidade contra bacteriófagos:

  1. A bactéria captura um fragmento do DNA viral, chamado protospacer, próximo de uma sequência PAM.
  2. Esse fragmento é incorporado no array CRISPR.
  3. O array é transcrito e processado em RNAs guia.
  4. O complexo Cas9:gRNA reconhece uma sequência viral complementar junto de uma PAM.
  5. A Cas9 corta o DNA, produzindo uma quebra de cadeia dupla.

No laboratório, usa-se uma versão simplificada, com um sgRNA sintético ou expresso a partir de plasmídeo, que guia a Cas9 até ao local alvo no genoma.

A Cas9 de Streptococcus pyogenes reconhece geralmente a sequência PAM NGG e corta o DNA cerca de 3 a 5 nucleótidos antes da PAM.

7. Knock-out, knock-in e selecção clonal

Depois de a Cas9 produzir uma quebra dupla no DNA, a célula repara essa lesão por diferentes vias:

  • NHEJ, ou junção de extremidades não homólogas: é propensa a erros e gera inserções ou deleções, frequentemente causando knock-out.
  • HDR, ou reparação dirigida por homologia: se for fornecido um molde, permite introduzir alterações específicas, produzindo knock-in.

Para gerar clones knock-out, o procedimento geral inclui:

  1. Transfecção das células com o plasmídeo CRISPR/Cas9.
  2. Separação das células fluorescentes por FACS, se o vector tiver marcador fluorescente.
  3. Isolamento e expansão clonal.
  4. Confirmação da perda da proteína por Western blot ou PCR.
  5. Extracção de DNA genómico.
  6. PCR da região alvo.
  7. Sequenciação para confirmar a alteração genómica.

Foi também mostrado como desenhar um plasmídeo CRISPR no VectorBuilder, escolhendo:

  • o tipo de vector;
  • um ou dois gRNAs;
  • a Cas9 de S. pyogenes;
  • um marcador, por exemplo mCherry, para seleccionar células transfectadas por fluorescência.

Ideia central da aula

A aula mostrou como desenhar ferramentas moleculares para responder a perguntas biológicas. Primeiro, constrói-se uma proteína de fusão para visualizar uma proteína em células vivas. Depois, introduzem-se mutações específicas para estudar o papel de modificações pós-traducionais. Finalmente, usa-se CRISPR/Cas9 para eliminar genes e estudar a função de uma proteína num contexto celular controlado.

Desenho experimental e construção de ferramentas moleculares (DEFM)

20 Fevereiro 2026, 09:00 • Federico Herrera Garcia

A aula abordou o desenho experimental e a construção de ferramentas moleculares para estudar proteínas em células de mamífero. O exemplo inicial foi a proteína STAT3, em que se pretende introduzir versões mutadas em células HeLa sem STAT3 endógeno, visualizar essas versões por fusão com uma proteína fluorescente e estudar o efeito de modificações pós-traducionais específicas.

1. Construção de plasmídeos de expressão em mamíferos

O primeiro grande tema foi a geração de um plasmídeo para expressar uma proteína de fusão Brawnin-mCherry em células de mamífero.

O objectivo é fusionar a proteína mitocondrial Brawnin, também chamada UQCC6, com a proteína fluorescente mCherry, de modo a visualizar Brawnin em células vivas. Como as duas proteínas ficam ligadas de forma irreversível, a fluorescência vermelha da mCherry indica a localização de Brawnin.

O vector usado é o pcDNA3.1(-), um plasmídeo de expressão em mamíferos. Foram discutidos os seus elementos principais:

  • MCS, ou local de clonagem múltipla: zona onde se inserem as sequências de interesse.
  • Promotor CMV: promove uma expressão forte e constitutiva em células de mamífero.
  • Sinal de poliadenilação: permite a adição da cauda polyA ao mRNA.
  • Origem de replicação bacteriana: permite a multiplicação do plasmídeo em bactérias, normalmente E. coli.
  • Genes de resistência a antibióticos:
    • Ampicilina, para seleccionar bactérias transformadas.
    • Higromicina, para seleccionar células de mamífero transfectadas.

Também foi introduzido o programa ApE, usado para visualizar mapas de plasmídeos, identificar “features” e localizar locais únicos de restrição.

2. Escolha e obtenção das sequências de interesse

A aula explicou como obter sequências fiáveis para clonagem.

Para Brawnin/UQCC6, a sequência da proteína humana é procurada no UniProt, mas como é necessário trabalhar com DNA, recorre-se depois à base de dados CCDS, que fornece a sequência codificante consenso em nucleótidos.

Para mCherry, como não é uma proteína natural mas sim uma proteína fluorescente derivada de DsRed, foi sugerido o uso da FPbase. A partir daí, pode-se aceder à sequência em UniProt e depois ao GenBank para obter a sequência codificante em nucleótidos.

Foi sublinhada a importância de confirmar:

  • se a sequência começa com ATG, o codão de iniciação;
  • se termina com um codão STOP, como TAA, TAG ou TGA;
  • se a sequência está no sentido correcto ou em reverse complement;
  • se a tradução da sequência de DNA corresponde à sequência proteica esperada.

3. Estratégia de clonagem da proteína de fusão Brawnin-mCherry

A construção desejada é uma fusão Brawnin-mCherry, nesta ordem. Isso significa que a mCherry ficará ligada ao extremo C-terminal da Brawnin.

A clonagem tradicional envolve amplificar as sequências por PCR, mas os primers são desenhados com “caudas” adicionais contendo locais de reconhecimento para enzimas de restrição. Assim, os produtos de PCR podem ser digeridos e inseridos no plasmídeo nos locais correctos.

Foram explicadas várias regras importantes:

  • As duas sequências devem ser inseridas no MCS.
  • A primeira sequência, Brawnin, não deve ter codão STOP, caso contrário a tradução terminaria antes da mCherry.
  • A segunda sequência, mCherry, deve ter o seu codão STOP.
  • Qualquer sequência entre Brawnin e mCherry será traduzida como parte da proteína final.
  • Essa sequência intermédia deve manter a grelha de leitura, ou seja, deve ter um número de nucleótidos múltiplo de 3.
  • As enzimas de restrição escolhidas devem cortar apenas uma vez no plasmídeo e não devem cortar dentro das sequências Brawnin ou mCherry.
  • Usar duas enzimas diferentes permite clonagem direccional, reduzindo o risco de o fragmento entrar invertido.
  • Extremos coesivos aumentam a eficiência e especificidade da ligação em comparação com extremos rombos.

4. Mutagénese dirigida e estudo de modificações pós-traducionais

O segundo grande tema foi a mutagénese dirigida, usada para estudar o papel de modificações pós-traducionais em proteínas.

Foram dados exemplos com STAT3, uma proteína regulada por fosforilação e acetilação:

  • A fosforilação em Y705 promove a retenção nuclear e activação transcricional.
  • A acetilação em K685 e a fosforilação em S727 podem modular a actividade transcricional.
  • A fosforilação em S701 também pode ser relevante em algumas isoformas.

Depois, os exercícios aplicaram estes conceitos à proteína Brawnin, focando três resíduos:

  • S65, uma serina potencialmente fosforilável.
  • Y10, uma tirosina potencialmente fosforilável.
  • K49, uma lisina potencialmente acetilável ou modificável de outras formas.

A ideia é substituir aminoácidos modificáveis por outros que:

  • não possam ser modificados;
  • imitem, tanto quanto possível, o estado modificado.

Exemplos típicos:

  • Serina ou treonina fosforilável podem ser substituídas por alanina para impedir fosforilação.
  • Serina ou treonina fosforilada pode ser parcialmente mimetizada por aspartato ou glutamato, por terem carga negativa.
  • Tirosina pode ser substituída por fenilalanina para impedir fosforilação, mantendo uma estrutura aromática semelhante.
  • Lisina pode ser substituída por arginina para manter carga positiva e impedir acetilação, ou por glutamina para imitar parcialmente uma lisina acetilada.

5. Como funciona a mutagénese dirigida

A mutagénese dirigida tradicional é feita por PCR usando o plasmídeo original como molde. Os primers contêm a mutação desejada no meio e regiões complementares longas nos lados, normalmente cerca de 15 a 20 nucleótidos de cada lado.

O procedimento geral inclui:

  1. Desenho de primers contendo a mutação.
  2. PCR para amplificar o plasmídeo completo.
  3. Digestão com DpnI.
  4. Transformação em E. coli.
  5. Extracção do DNA plasmídico.
  6. Sequenciação para confirmar que a mutação foi introduzida correctamente.

O papel da DpnI é degradar o plasmídeo parental metilado, que veio de bactérias, deixando preferencialmente o DNA recém-sintetizado pela PCR, que contém a mutação.

Foi também apresentado o uso da ferramenta online PrimerX para desenhar primers de mutagénese. A sequência inserida deve incluir apenas uma região suficiente em torno da mutação, com mais de 30 a 40 nucleótidos de cada lado, e não necessariamente o plasmídeo inteiro.

6. Ferramentas CRISPR/Cas9

A terceira parte da aula focou a geração de uma ferramenta CRISPR/Cas9 para produzir knock-outs.

No sistema natural bacteriano, o CRISPR/Cas funciona como uma forma de imunidade contra bacteriófagos:

  1. A bactéria captura um fragmento do DNA viral, chamado protospacer, próximo de uma sequência PAM.
  2. Esse fragmento é incorporado no array CRISPR.
  3. O array é transcrito e processado em RNAs guia.
  4. O complexo Cas9:gRNA reconhece uma sequência viral complementar junto de uma PAM.
  5. A Cas9 corta o DNA, produzindo uma quebra de cadeia dupla.

No laboratório, usa-se uma versão simplificada, com um sgRNA sintético ou expresso a partir de plasmídeo, que guia a Cas9 até ao local alvo no genoma.

A Cas9 de Streptococcus pyogenes reconhece geralmente a sequência PAM NGG e corta o DNA cerca de 3 a 5 nucleótidos antes da PAM.

7. Knock-out, knock-in e selecção clonal

Depois de a Cas9 produzir uma quebra dupla no DNA, a célula repara essa lesão por diferentes vias:

  • NHEJ, ou junção de extremidades não homólogas: é propensa a erros e gera inserções ou deleções, frequentemente causando knock-out.
  • HDR, ou reparação dirigida por homologia: se for fornecido um molde, permite introduzir alterações específicas, produzindo knock-in.

Para gerar clones knock-out, o procedimento geral inclui:

  1. Transfecção das células com o plasmídeo CRISPR/Cas9.
  2. Separação das células fluorescentes por FACS, se o vector tiver marcador fluorescente.
  3. Isolamento e expansão clonal.
  4. Confirmação da perda da proteína por Western blot ou PCR.
  5. Extracção de DNA genómico.
  6. PCR da região alvo.
  7. Sequenciação para confirmar a alteração genómica.

Foi também mostrado como desenhar um plasmídeo CRISPR no VectorBuilder, escolhendo:

  • o tipo de vector;
  • um ou dois gRNAs;
  • a Cas9 de S. pyogenes;
  • um marcador, por exemplo mCherry, para seleccionar células transfectadas por fluorescência.

Ideia central da aula

A aula mostrou como desenhar ferramentas moleculares para responder a perguntas biológicas. Primeiro, constrói-se uma proteína de fusão para visualizar uma proteína em células vivas. Depois, introduzem-se mutações específicas para estudar o papel de modificações pós-traducionais. Finalmente, usa-se CRISPR/Cas9 para eliminar genes e estudar a função de uma proteína num contexto celular controlado.

Desenho experimental e construção de ferramentas moleculares (DEFM)

19 Fevereiro 2026, 14:00 • Federico Herrera Garcia

A aula abordou o desenho experimental e a construção de ferramentas moleculares para estudar proteínas em células de mamífero. O exemplo inicial foi a proteína STAT3, em que se pretende introduzir versões mutadas em células HeLa sem STAT3 endógeno, visualizar essas versões por fusão com uma proteína fluorescente e estudar o efeito de modificações pós-traducionais específicas.

1. Construção de plasmídeos de expressão em mamíferos

O primeiro grande tema foi a geração de um plasmídeo para expressar uma proteína de fusão Brawnin-mCherry em células de mamífero.

O objectivo é fusionar a proteína mitocondrial Brawnin, também chamada UQCC6, com a proteína fluorescente mCherry, de modo a visualizar Brawnin em células vivas. Como as duas proteínas ficam ligadas de forma irreversível, a fluorescência vermelha da mCherry indica a localização de Brawnin.

O vector usado é o pcDNA3.1(-), um plasmídeo de expressão em mamíferos. Foram discutidos os seus elementos principais:

  • MCS, ou local de clonagem múltipla: zona onde se inserem as sequências de interesse.
  • Promotor CMV: promove uma expressão forte e constitutiva em células de mamífero.
  • Sinal de poliadenilação: permite a adição da cauda polyA ao mRNA.
  • Origem de replicação bacteriana: permite a multiplicação do plasmídeo em bactérias, normalmente E. coli.
  • Genes de resistência a antibióticos:
    • Ampicilina, para seleccionar bactérias transformadas.
    • Higromicina, para seleccionar células de mamífero transfectadas.

Também foi introduzido o programa ApE, usado para visualizar mapas de plasmídeos, identificar “features” e localizar locais únicos de restrição.

2. Escolha e obtenção das sequências de interesse

A aula explicou como obter sequências fiáveis para clonagem.

Para Brawnin/UQCC6, a sequência da proteína humana é procurada no UniProt, mas como é necessário trabalhar com DNA, recorre-se depois à base de dados CCDS, que fornece a sequência codificante consenso em nucleótidos.

Para mCherry, como não é uma proteína natural mas sim uma proteína fluorescente derivada de DsRed, foi sugerido o uso da FPbase. A partir daí, pode-se aceder à sequência em UniProt e depois ao GenBank para obter a sequência codificante em nucleótidos.

Foi sublinhada a importância de confirmar:

  • se a sequência começa com ATG, o codão de iniciação;
  • se termina com um codão STOP, como TAA, TAG ou TGA;
  • se a sequência está no sentido correcto ou em reverse complement;
  • se a tradução da sequência de DNA corresponde à sequência proteica esperada.

3. Estratégia de clonagem da proteína de fusão Brawnin-mCherry

A construção desejada é uma fusão Brawnin-mCherry, nesta ordem. Isso significa que a mCherry ficará ligada ao extremo C-terminal da Brawnin.

A clonagem tradicional envolve amplificar as sequências por PCR, mas os primers são desenhados com “caudas” adicionais contendo locais de reconhecimento para enzimas de restrição. Assim, os produtos de PCR podem ser digeridos e inseridos no plasmídeo nos locais correctos.

Foram explicadas várias regras importantes:

  • As duas sequências devem ser inseridas no MCS.
  • A primeira sequência, Brawnin, não deve ter codão STOP, caso contrário a tradução terminaria antes da mCherry.
  • A segunda sequência, mCherry, deve ter o seu codão STOP.
  • Qualquer sequência entre Brawnin e mCherry será traduzida como parte da proteína final.
  • Essa sequência intermédia deve manter a grelha de leitura, ou seja, deve ter um número de nucleótidos múltiplo de 3.
  • As enzimas de restrição escolhidas devem cortar apenas uma vez no plasmídeo e não devem cortar dentro das sequências Brawnin ou mCherry.
  • Usar duas enzimas diferentes permite clonagem direccional, reduzindo o risco de o fragmento entrar invertido.
  • Extremos coesivos aumentam a eficiência e especificidade da ligação em comparação com extremos rombos.

4. Mutagénese dirigida e estudo de modificações pós-traducionais

O segundo grande tema foi a mutagénese dirigida, usada para estudar o papel de modificações pós-traducionais em proteínas.

Foram dados exemplos com STAT3, uma proteína regulada por fosforilação e acetilação:

  • A fosforilação em Y705 promove a retenção nuclear e activação transcricional.
  • A acetilação em K685 e a fosforilação em S727 podem modular a actividade transcricional.
  • A fosforilação em S701 também pode ser relevante em algumas isoformas.

Depois, os exercícios aplicaram estes conceitos à proteína Brawnin, focando três resíduos:

  • S65, uma serina potencialmente fosforilável.
  • Y10, uma tirosina potencialmente fosforilável.
  • K49, uma lisina potencialmente acetilável ou modificável de outras formas.

A ideia é substituir aminoácidos modificáveis por outros que:

  • não possam ser modificados;
  • imitem, tanto quanto possível, o estado modificado.

Exemplos típicos:

  • Serina ou treonina fosforilável podem ser substituídas por alanina para impedir fosforilação.
  • Serina ou treonina fosforilada pode ser parcialmente mimetizada por aspartato ou glutamato, por terem carga negativa.
  • Tirosina pode ser substituída por fenilalanina para impedir fosforilação, mantendo uma estrutura aromática semelhante.
  • Lisina pode ser substituída por arginina para manter carga positiva e impedir acetilação, ou por glutamina para imitar parcialmente uma lisina acetilada.

5. Como funciona a mutagénese dirigida

A mutagénese dirigida tradicional é feita por PCR usando o plasmídeo original como molde. Os primers contêm a mutação desejada no meio e regiões complementares longas nos lados, normalmente cerca de 15 a 20 nucleótidos de cada lado.

O procedimento geral inclui:

  1. Desenho de primers contendo a mutação.
  2. PCR para amplificar o plasmídeo completo.
  3. Digestão com DpnI.
  4. Transformação em E. coli.
  5. Extracção do DNA plasmídico.
  6. Sequenciação para confirmar que a mutação foi introduzida correctamente.

O papel da DpnI é degradar o plasmídeo parental metilado, que veio de bactérias, deixando preferencialmente o DNA recém-sintetizado pela PCR, que contém a mutação.

Foi também apresentado o uso da ferramenta online PrimerX para desenhar primers de mutagénese. A sequência inserida deve incluir apenas uma região suficiente em torno da mutação, com mais de 30 a 40 nucleótidos de cada lado, e não necessariamente o plasmídeo inteiro.

6. Ferramentas CRISPR/Cas9

A terceira parte da aula focou a geração de uma ferramenta CRISPR/Cas9 para produzir knock-outs.

No sistema natural bacteriano, o CRISPR/Cas funciona como uma forma de imunidade contra bacteriófagos:

  1. A bactéria captura um fragmento do DNA viral, chamado protospacer, próximo de uma sequência PAM.
  2. Esse fragmento é incorporado no array CRISPR.
  3. O array é transcrito e processado em RNAs guia.
  4. O complexo Cas9:gRNA reconhece uma sequência viral complementar junto de uma PAM.
  5. A Cas9 corta o DNA, produzindo uma quebra de cadeia dupla.

No laboratório, usa-se uma versão simplificada, com um sgRNA sintético ou expresso a partir de plasmídeo, que guia a Cas9 até ao local alvo no genoma.

A Cas9 de Streptococcus pyogenes reconhece geralmente a sequência PAM NGG e corta o DNA cerca de 3 a 5 nucleótidos antes da PAM.

7. Knock-out, knock-in e selecção clonal

Depois de a Cas9 produzir uma quebra dupla no DNA, a célula repara essa lesão por diferentes vias:

  • NHEJ, ou junção de extremidades não homólogas: é propensa a erros e gera inserções ou deleções, frequentemente causando knock-out.
  • HDR, ou reparação dirigida por homologia: se for fornecido um molde, permite introduzir alterações específicas, produzindo knock-in.

Para gerar clones knock-out, o procedimento geral inclui:

  1. Transfecção das células com o plasmídeo CRISPR/Cas9.
  2. Separação das células fluorescentes por FACS, se o vector tiver marcador fluorescente.
  3. Isolamento e expansão clonal.
  4. Confirmação da perda da proteína por Western blot ou PCR.
  5. Extracção de DNA genómico.
  6. PCR da região alvo.
  7. Sequenciação para confirmar a alteração genómica.

Foi também mostrado como desenhar um plasmídeo CRISPR no VectorBuilder, escolhendo:

  • o tipo de vector;
  • um ou dois gRNAs;
  • a Cas9 de S. pyogenes;
  • um marcador, por exemplo mCherry, para seleccionar células transfectadas por fluorescência.

Ideia central da aula

A aula mostrou como desenhar ferramentas moleculares para responder a perguntas biológicas. Primeiro, constrói-se uma proteína de fusão para visualizar uma proteína em células vivas. Depois, introduzem-se mutações específicas para estudar o papel de modificações pós-traducionais. Finalmente, usa-se CRISPR/Cas9 para eliminar genes e estudar a função de uma proteína num contexto celular controlado.

Desenho experimental e construção de ferramentas moleculares (DEFM)

19 Fevereiro 2026, 09:00 • Federico Herrera Garcia

A aula abordou o desenho experimental e a construção de ferramentas moleculares para estudar proteínas em células de mamífero. O exemplo inicial foi a proteína STAT3, em que se pretende introduzir versões mutadas em células HeLa sem STAT3 endógeno, visualizar essas versões por fusão com uma proteína fluorescente e estudar o efeito de modificações pós-traducionais específicas.

1. Construção de plasmídeos de expressão em mamíferos

O primeiro grande tema foi a geração de um plasmídeo para expressar uma proteína de fusão Brawnin-mCherry em células de mamífero.

O objectivo é fusionar a proteína mitocondrial Brawnin, também chamada UQCC6, com a proteína fluorescente mCherry, de modo a visualizar Brawnin em células vivas. Como as duas proteínas ficam ligadas de forma irreversível, a fluorescência vermelha da mCherry indica a localização de Brawnin.

O vector usado é o pcDNA3.1(-), um plasmídeo de expressão em mamíferos. Foram discutidos os seus elementos principais:

  • MCS, ou local de clonagem múltipla: zona onde se inserem as sequências de interesse.
  • Promotor CMV: promove uma expressão forte e constitutiva em células de mamífero.
  • Sinal de poliadenilação: permite a adição da cauda polyA ao mRNA.
  • Origem de replicação bacteriana: permite a multiplicação do plasmídeo em bactérias, normalmente E. coli.
  • Genes de resistência a antibióticos:
    • Ampicilina, para seleccionar bactérias transformadas.
    • Higromicina, para seleccionar células de mamífero transfectadas.

Também foi introduzido o programa ApE, usado para visualizar mapas de plasmídeos, identificar “features” e localizar locais únicos de restrição.

2. Escolha e obtenção das sequências de interesse

A aula explicou como obter sequências fiáveis para clonagem.

Para Brawnin/UQCC6, a sequência da proteína humana é procurada no UniProt, mas como é necessário trabalhar com DNA, recorre-se depois à base de dados CCDS, que fornece a sequência codificante consenso em nucleótidos.

Para mCherry, como não é uma proteína natural mas sim uma proteína fluorescente derivada de DsRed, foi sugerido o uso da FPbase. A partir daí, pode-se aceder à sequência em UniProt e depois ao GenBank para obter a sequência codificante em nucleótidos.

Foi sublinhada a importância de confirmar:

  • se a sequência começa com ATG, o codão de iniciação;
  • se termina com um codão STOP, como TAA, TAG ou TGA;
  • se a sequência está no sentido correcto ou em reverse complement;
  • se a tradução da sequência de DNA corresponde à sequência proteica esperada.

3. Estratégia de clonagem da proteína de fusão Brawnin-mCherry

A construção desejada é uma fusão Brawnin-mCherry, nesta ordem. Isso significa que a mCherry ficará ligada ao extremo C-terminal da Brawnin.

A clonagem tradicional envolve amplificar as sequências por PCR, mas os primers são desenhados com “caudas” adicionais contendo locais de reconhecimento para enzimas de restrição. Assim, os produtos de PCR podem ser digeridos e inseridos no plasmídeo nos locais correctos.

Foram explicadas várias regras importantes:

  • As duas sequências devem ser inseridas no MCS.
  • A primeira sequência, Brawnin, não deve ter codão STOP, caso contrário a tradução terminaria antes da mCherry.
  • A segunda sequência, mCherry, deve ter o seu codão STOP.
  • Qualquer sequência entre Brawnin e mCherry será traduzida como parte da proteína final.
  • Essa sequência intermédia deve manter a grelha de leitura, ou seja, deve ter um número de nucleótidos múltiplo de 3.
  • As enzimas de restrição escolhidas devem cortar apenas uma vez no plasmídeo e não devem cortar dentro das sequências Brawnin ou mCherry.
  • Usar duas enzimas diferentes permite clonagem direccional, reduzindo o risco de o fragmento entrar invertido.
  • Extremos coesivos aumentam a eficiência e especificidade da ligação em comparação com extremos rombos.

4. Mutagénese dirigida e estudo de modificações pós-traducionais

O segundo grande tema foi a mutagénese dirigida, usada para estudar o papel de modificações pós-traducionais em proteínas.

Foram dados exemplos com STAT3, uma proteína regulada por fosforilação e acetilação:

  • A fosforilação em Y705 promove a retenção nuclear e activação transcricional.
  • A acetilação em K685 e a fosforilação em S727 podem modular a actividade transcricional.
  • A fosforilação em S701 também pode ser relevante em algumas isoformas.

Depois, os exercícios aplicaram estes conceitos à proteína Brawnin, focando três resíduos:

  • S65, uma serina potencialmente fosforilável.
  • Y10, uma tirosina potencialmente fosforilável.
  • K49, uma lisina potencialmente acetilável ou modificável de outras formas.

A ideia é substituir aminoácidos modificáveis por outros que:

  • não possam ser modificados;
  • imitem, tanto quanto possível, o estado modificado.

Exemplos típicos:

  • Serina ou treonina fosforilável podem ser substituídas por alanina para impedir fosforilação.
  • Serina ou treonina fosforilada pode ser parcialmente mimetizada por aspartato ou glutamato, por terem carga negativa.
  • Tirosina pode ser substituída por fenilalanina para impedir fosforilação, mantendo uma estrutura aromática semelhante.
  • Lisina pode ser substituída por arginina para manter carga positiva e impedir acetilação, ou por glutamina para imitar parcialmente uma lisina acetilada.

5. Como funciona a mutagénese dirigida

A mutagénese dirigida tradicional é feita por PCR usando o plasmídeo original como molde. Os primers contêm a mutação desejada no meio e regiões complementares longas nos lados, normalmente cerca de 15 a 20 nucleótidos de cada lado.

O procedimento geral inclui:

  1. Desenho de primers contendo a mutação.
  2. PCR para amplificar o plasmídeo completo.
  3. Digestão com DpnI.
  4. Transformação em E. coli.
  5. Extracção do DNA plasmídico.
  6. Sequenciação para confirmar que a mutação foi introduzida correctamente.

O papel da DpnI é degradar o plasmídeo parental metilado, que veio de bactérias, deixando preferencialmente o DNA recém-sintetizado pela PCR, que contém a mutação.

Foi também apresentado o uso da ferramenta online PrimerX para desenhar primers de mutagénese. A sequência inserida deve incluir apenas uma região suficiente em torno da mutação, com mais de 30 a 40 nucleótidos de cada lado, e não necessariamente o plasmídeo inteiro.

6. Ferramentas CRISPR/Cas9

A terceira parte da aula focou a geração de uma ferramenta CRISPR/Cas9 para produzir knock-outs.

No sistema natural bacteriano, o CRISPR/Cas funciona como uma forma de imunidade contra bacteriófagos:

  1. A bactéria captura um fragmento do DNA viral, chamado protospacer, próximo de uma sequência PAM.
  2. Esse fragmento é incorporado no array CRISPR.
  3. O array é transcrito e processado em RNAs guia.
  4. O complexo Cas9:gRNA reconhece uma sequência viral complementar junto de uma PAM.
  5. A Cas9 corta o DNA, produzindo uma quebra de cadeia dupla.

No laboratório, usa-se uma versão simplificada, com um sgRNA sintético ou expresso a partir de plasmídeo, que guia a Cas9 até ao local alvo no genoma.

A Cas9 de Streptococcus pyogenes reconhece geralmente a sequência PAM NGG e corta o DNA cerca de 3 a 5 nucleótidos antes da PAM.

7. Knock-out, knock-in e selecção clonal

Depois de a Cas9 produzir uma quebra dupla no DNA, a célula repara essa lesão por diferentes vias:

  • NHEJ, ou junção de extremidades não homólogas: é propensa a erros e gera inserções ou deleções, frequentemente causando knock-out.
  • HDR, ou reparação dirigida por homologia: se for fornecido um molde, permite introduzir alterações específicas, produzindo knock-in.

Para gerar clones knock-out, o procedimento geral inclui:

  1. Transfecção das células com o plasmídeo CRISPR/Cas9.
  2. Separação das células fluorescentes por FACS, se o vector tiver marcador fluorescente.
  3. Isolamento e expansão clonal.
  4. Confirmação da perda da proteína por Western blot ou PCR.
  5. Extracção de DNA genómico.
  6. PCR da região alvo.
  7. Sequenciação para confirmar a alteração genómica.

Foi também mostrado como desenhar um plasmídeo CRISPR no VectorBuilder, escolhendo:

  • o tipo de vector;
  • um ou dois gRNAs;
  • a Cas9 de S. pyogenes;
  • um marcador, por exemplo mCherry, para seleccionar células transfectadas por fluorescência.

Ideia central da aula

A aula mostrou como desenhar ferramentas moleculares para responder a perguntas biológicas. Primeiro, constrói-se uma proteína de fusão para visualizar uma proteína em células vivas. Depois, introduzem-se mutações específicas para estudar o papel de modificações pós-traducionais. Finalmente, usa-se CRISPR/Cas9 para eliminar genes e estudar a função de uma proteína num contexto celular controlado.