Sumários

Aulas 5-6

7 Maio 2019, 13:00 • Solveig Thorsteinsdottir

AULA 5

O primeiro dia de hibridação in situ com os embriões de galinha obtidos na aula 4.

Dia 1 da hibridação in situ:

Rehidratação dos embriões:

  1. Colocar em (encher 2/3 do tubo):

75% metanol em PBT 5 min

50% metanol em PBT 5 min

25% metanol em PBT 5 min

  1. Lavar 2 vezes em PBT

Permeabilização e posterior fixação dos embriões:

  1. Permeabilização dos embriões em proteinase K em PBT a 10 mg/ml (stock a 20 mg/ml: 25 µl PK – 50 ml PBT) a temperatura ambiente. O tempo de permeabilização depende do estádio do embrião (estádio HH = minutos; e.g. estádio HH10 = 10 min).
  2. Lavar 2 vezes em PBT a temperatura ambiente. Cuidado: os embriões são frágeis!
  3. Pós-fixação dos embriões durante 20 min a temperatura ambiente
  4. Lavar 2 vezes em PBT a temperatura ambiente

Preparação dos embriões para hibridação in situ:

  1.  Passar por mistura PBT:Hibmix (1:1) (previamente aquecida até 70ºC)
  2.  Passar por Hibmix (70ºC)
  3.  Incubar em Hibmix durante 1 h a 70ºC

Hibridação in situ:

  1. Tirar Hibmix e colocar Hibmix com sonda (só o suficiente para cobrir os embriões!) e incubar “overnight” a 70ºC*.

(Sonda tem todos os U’s conjugados com a proteina dioxigenina (DIG))

* temperatura depende das características da sonda

 

AULA 6

 

Este procedimento foi feito nos dias 8 e 9 de abril.

Continuação da aula anterior. Foi executado o protocolo do segundo e terceiro dia de hibridação in situ segundo o seguinte protocolo. Nota que os alunos fizeram esta aula no horário que tinham disponível nos dias 8 e 9 de abril, totalizando 4 horas de aula.

Dia 2 da hibridação in situ:

Lavagens pós-hibridação:

  1.  Recuperar Hibmix com sonda (não deitar fora!!) e guardar a -20ºC.
  2.  Lavar os embriões 2 vezes com Hibmix previamente aquecida
  3.  Lavar 30 min com Hibmix a 70ºC (usar aprox. 1.5 ml)
  4.  Lavar 10 min com mistura Hibmix: TBST (1:1; previamente aquecida). Deixar a temperatura ambiente para arrefecer lentamente.
  5.  Lavar 2 vezes em TBSTa temperatura ambiente
  6.  Lavar 15 min em TBST no “roller”

Preparação para detecção da sonda por imunohistoquímica:

  1. Incubar em TBST com 2% blocking e 20% soro de ovelha durante 1 h a temperatura ambiente no “roller”

Detecção da sonda por imunohistoquímica:

  1.  Adicionar o anticorpo anti-DIG conjugado com fosfatase alcalina (diluido 1:2000 em TBST com 2% blocking e 20% soro) e incubar “overnight” a 4ºC

Dia 3 da hibridação in situ

Lavagens pós-imunohistoquímica:

  1.  Lavar 3 vezes em TBST a temperatura ambiente
  2.  Lavar 3 vezes 1 hora em TBST com agitação a temperatura ambiente no “roller”
  3.  Deixar a 4ºC em TBST até a próxima aula

 

 

 

Not Taught.

7 Maio 2019, 08:00 • Solveig Thorsteinsdottir

Esta turma não existe.

Not Taught.

7 Maio 2019, 08:00 • Solveig Thorsteinsdottir

A BDA tem uma carga horária de aulas práticas de 2h por semana mas são lecionadas em aulas de 4h 15 em 15 dias. Sendo assim nesta data, esta turma não teve aula prática.

Aula 17 - somitogénese 1

6 Maio 2019, 15:00 • Solveig Thorsteinsdottir

A formação dos segmentos nos embriões de vertebrados. A formação dos segmentos mesodérmicos através da somitogénese. A natureza temporal da somitogénese. O modelo “clock and wavefront”. O relógio molecular da somitogénese. As experiências da Isabel Palmeirim. A a sinalização notch como output do relógio molecular. As vias Wnt e Fgf como participantes nesse output. O possível papel do Fgf8 e Wnt3a na manutenção das oscilações de expressão dos genes do relógio. O Fgf8 como um gradiente de degradação de mRNA. A frente de determinação e a entrada num ambiente sem Fgf8 (wavefront) prepara as células para a somitogénese.

Aula 16 - padronização do sistema nervoso central 2 e a crista neural

2 Maio 2019, 17:30 • Solveig Thorsteinsdottir

Padronização antero-posterior do sistema nervoso central: o gradiente Wnt8 abordado anteriormente. A regionalização do cérebro através de ativação de fatores de transcrição específicos. O papel da constelação de fatores de transcrição no estabelecimento dos centros de organização secundários: o organizador istmico, a zona limitans intratalámica e a região anterior neural e os seus morfogénios, Fgf8, Shh e Fgf8 respetivamente. O papel destes fatores parácrinos na regionalização ainda mais fina das diferentes regiões do cérebro.

A crista neural e o sistema nervoso periférico. A crista neural e os seus principais derivados. O papel do snail na delaminação da crista neural. As vias de migração das células da crista neural.