Sumários

Not Taught.

21 Maio 2019, 08:00 • Solveig Thorsteinsdottir

Esta turma não existe.

Aula 21 - desenvolvimento dos membros dos tetrápodes

20 Maio 2019, 15:00 • Solveig Thorsteinsdottir

Desenvolvimento dos membros dos tetrápodes. A estrutura dos membros é semelhante em todos os grupos de tetrápodes. A indução do botão do membro e a formação do “apical ectodermal ridge” (AER). O papel do loop Fgf10-Wnt3a-Fgf8 no crescimento do botão do membro. O modelo de dois gradientes. O modelo reacção-difusão de Newman e Baht (2007).

Qualquer que seja a teoria correta da padronização do eixo proximo-distal, todos são compatíveis com que a identidade dos segmentos ao longo do eixo proximo-distal é determinado pelos genes Hox (Hox9-13). Alguns fenótipos de knock-out de genes Hox nos membros dão consistência a essa proposta.

Aula 20 - diferenciação dos sómitos 2 e o código Hox na mesoderme e endoderme

16 Maio 2019, 17:30 • Solveig Thorsteinsdottir

A aquisição de identidade dos sómitos. A identidade antero-posterior dos sómitos é fixa. Tal como na Drosphila, a identidade dos segmentos é determinado pelos genes Hox. Os quatro conjuntos de genes Hox nos vertebrados (Hoxa, Hoxb, Hoxc e Hoxd). Possível evolução dos genes Hox. A expressão dos genes Hox ao longo do eixo antero-posterior. Os fenótipos dos knock-outs dos genes Hox. As experiências do Moises Mallo e equipa que mostraram que o código Hox actua já na mesoderme presomítica, antes da formação dos segmentos. 

Desenvolvimento da endoderme. O papel do código Hox na definição das diferentes regiões do tubo digestivo

Not Taught.

14 Maio 2019, 13:00 • Solveig Thorsteinsdottir

A BDA tem uma carga horária de aulas práticas de 2h por semana mas são lecionadas em aulas de 4h 15 em 15 dias. Sendo assim nesta data, esta turma não teve aula prática.

Aulas 5-6

14 Maio 2019, 13:00 • Solveig Thorsteinsdottir

AULA 5

O primeiro dia de hibridação in situ com os embriões de galinha obtidos na aula 4.

Dia 1 da hibridação in situ:

Rehidratação dos embriões:

  1. Colocar em (encher 2/3 do tubo):

75% metanol em PBT 5 min

50% metanol em PBT 5 min

25% metanol em PBT 5 min

  1. Lavar 2 vezes em PBT

Permeabilização e posterior fixação dos embriões:

  1. Permeabilização dos embriões em proteinase K em PBT a 10 mg/ml (stock a 20 mg/ml: 25 µl PK – 50 ml PBT) a temperatura ambiente. O tempo de permeabilização depende do estádio do embrião (estádio HH = minutos; e.g. estádio HH10 = 10 min).
  2. Lavar 2 vezes em PBT a temperatura ambiente. Cuidado: os embriões são frágeis!
  3. Pós-fixação dos embriões durante 20 min a temperatura ambiente
  4. Lavar 2 vezes em PBT a temperatura ambiente

Preparação dos embriões para hibridação in situ:

  1.  Passar por mistura PBT:Hibmix (1:1) (previamente aquecida até 70ºC)
  2.  Passar por Hibmix (70ºC)
  3.  Incubar em Hibmix durante 1 h a 70ºC

Hibridação in situ:

  1. Tirar Hibmix e colocar Hibmix com sonda (só o suficiente para cobrir os embriões!) e incubar “overnight” a 70ºC*.

(Sonda tem todos os U’s conjugados com a proteina dioxigenina (DIG))

* temperatura depende das características da sonda

 

AULA 6

 

Este procedimento foi feito nos dias 15 e 16 de abril.

Continuação da aula anterior. Foi executado o protocolo do segundo e terceiro dia de hibridação in situ segundo o seguinte protocolo. Nota que os alunos fizeram esta aula no horário que tinham disponível nos dias 15 e 16 de abril, totalizando 4 horas de aula.

Dia 2 da hibridação in situ:

Lavagens pós-hibridação:

  1.  Recuperar Hibmix com sonda (não deitar fora!!) e guardar a -20ºC.
  2.  Lavar os embriões 2 vezes com Hibmix previamente aquecida
  3.  Lavar 30 min com Hibmix a 70ºC (usar aprox. 1.5 ml)
  4.  Lavar 10 min com mistura Hibmix: TBST (1:1; previamente aquecida). Deixar a temperatura ambiente para arrefecer lentamente.
  5.  Lavar 2 vezes em TBSTa temperatura ambiente
  6.  Lavar 15 min em TBST no “roller”

Preparação para detecção da sonda por imunohistoquímica:

  1. Incubar em TBST com 2% blocking e 20% soro de ovelha durante 1 h a temperatura ambiente no “roller”

Detecção da sonda por imunohistoquímica:

  1.  Adicionar o anticorpo anti-DIG conjugado com fosfatase alcalina (diluido 1:2000 em TBST com 2% blocking e 20% soro) e incubar “overnight” a 4ºC

Dia 3 da hibridação in situ

Lavagens pós-imunohistoquímica:

  1.  Lavar 3 vezes em TBST a temperatura ambiente
  2.  Lavar 3 vezes 1 hora em TBST com agitação a temperatura ambiente no “roller”
  3.  Deixar a 4ºC em TBST até a próxima aula