Aula Prática 1 - ouriço-do-mar

28 Fevereiro 2023, 08:00 • Solveig Thorsteinsdottir

Fertilização o desenvolvimento precoce no ouriço-do-mar ao vivo.

Objectivo 1: Observação de oócitos e espermatozóides

Objectivo 2: Observação da fertilização.

Objectivo 3: Observação das modificações que ocorrem ao nível do núcleo e citoplasma até a primeira divisão mitotica. Observação da segunda clivagem. Opcional: obervação de gastrulas e larvas pluteus no dia seguinte.

Objectivo 4: Executar uma experiência que testa o efeito da concentração dos espermatozóides no (1) sucesso da fertilização e (2) a incidência de polispermia. Elaboração de um gráfico com os resultados obtidos.

Protocolo da aula:

Observação de oócitos:

·      Colocar uma gota de oócitos em água do mar numa lâmina e observar no microscópio (obj. 10x - não usar a objectiva de 40x!!). Identificar oócitos maduros e imaturos.

·      Adicionar uma gota muito pequena de tinta de China e misturar com um palito. Observar a geleia.

Observação de espermatozóides:

(só podem usar a objetiva de 40x COM LAMELA - a água do mar destrói objectivas!).

·      Preparar sémen diluído em água do mar. Observar com a objetiva de 10x sem lamela e depois colocar uma lamela e observar com a objetiva de 40x

Fertilização:

·      Preparar uma caixa de Petri com oócitos em água do mar. Colocar uma gota de oócitos numa lâmina, colocar no microscópio e focar com a objetiva de 10x. 

·      A docente adiciona esperma diluído à caixa de Petri (vai ser usado para observar as fases de clivagem) e coloca uma gota de esperma na lâmina.

·      Juntar a gota de esperma com a gota de oócitos usando um palito. Observar a fertilização.

Clivagem:

·        Retirar uma gota de embriões em clivagem da caixa de Petri e observar sem lamela com a objetiva de 10x. Observar a alteração ao nível do núcleo e a formação do fuso mitótico.Observar a 1ª divisão mitótica (±40-50* min após a fertilização), a 2ª divisão mitótica (10-15* min após a 1ª) e a 3ª divisão mitótica (10-15* min após a 2ª). *depende da temperatura da sala

Aula 4

27 Fevereiro 2023, 15:00 • Solveig Thorsteinsdottir

Como se explica a formação de células diferentes? Conceito de equivalência genómica. Clonagem de organismos a partir de um núcleo de uma célula diferenciada prova o conceito de equivalência genómica (e.g Dolly). Estabelecida a equivalência genómica, pergunta-se como se formam células diferentes no embrião? A resposta é expressão génica diferencial. Definição de "expressão génica". Discussão breve sobre os níveis onde pode haver regulação da expressão génica.

O primeiro nível: a transcrição. Estrutura da cromatina, o gene, o promotor, os enhancers, factores de transcição (principais famílias) e os seus efeitos positivos ou negativos. O conceito de "constelação de fatores de transcrição". Exemplos de reprogramação nuclear (células iPS e outros exemplos). O segundo nível: o processamento do RNA nuclear e o transporte de mRNA para o citoplasma. Splicing alternativo permite a formação de multiplas proteínas a partir de um único gene. Exemplos (e.g. splicing alternativo de Dscam em Drosophila e em Vertebrados). O terceiro nível: inhibição selectiva de tradução do mRNA (e.g. através de determinadas proteínas que bloqueiam a tradução; através de miRNAs). Exemplos (e.g. a “limpeza” de mRNA maternos no embrião do peixe zebra). Quarto nível: processamento pós-traducionais de proteínas.

Aula 3

23 Fevereiro 2023, 17:30 • Solveig Thorsteinsdottir

Os gâmetas do ouriço-do-mar. A fertilização no ouriço-do-mar. A fertilização divide-se em quatro etapas:

1.     Contacto e reconhecimento entre o espermatozoide e o oócito (espécie específico)

2.     Regulação da entrada do espe espermatozoide pelo oócito (bloqueio a poliespermia)

3.     Mistura do material genético dos gâmetas

4.     Activação do metabolismo do oócito e o início do desenvolvimento.

A geleia do oócito liberta uma substância (resact) que atrai o espermatozoide por quimiotaxia. Quando o espermatozoide toca na geleia inicia-se a reação acrossomal. As enzimas libertadas pelo acrossoma digerem a geleia e o espermatozoide chega à câmada vitelina onde se liga ao receptor de bindina, especie específico, que permite a fusão entre o espermatozoide e o oócito. Logo após a entrada do espermatozoide, o oócito ativa duas defesas contra a poliespermia: o bloqueio rápido (despolarização da membrana do oócito) e o bloqueio lento (a exocitose dos grânulos corticais e o consequente afastamento da membrana de fertilização. Logo a seguir ocorre a ativação do metabolismo do oócito e o desenvolvimento embrionário começa: o oócito fertilizado divide-se em blastómeros, uma fase chamada clivagem. Comparação com a clivagem de outros grupos animais.

Especificação celular: diferentes estratégias: especificação autónoma, especificação condicional, especificação em sincício. 

Aula 2

16 Fevereiro 2023, 17:30 • Solveig Thorsteinsdottir

A origem embrionária e o desenvolvimento das células primordiais germinais, as células precursoras dos gâmetas. O plasma germinal vs a indução das células primordias germinais. A hipotese do genoma inerte. A migração das células precursoras dos gâmetas e a sua chegada às gonadas. A chegada das células precursoras dos gâmetas à gónada indiferenciada.

Não houve aula

14 Fevereiro 2023, 13:00 • Solveig Thorsteinsdottir

Não damos aulas práticas na 1ª semana de aulas.