Aula 21

11 Maio 2023, 17:30 • Solveig Thorsteinsdottir

Os diferentes derivados dos sómitos. A polarização dorso-ventral e medio-lateral dos sómitos é mediada por factores parácrinos segregados pelos tecidos adjacentes. Experiências que mostraram que a notocorda induz a formação do esclerótomo e que o factor responsável é o sonic hedgehog.

A iniciação da miogénese – o papel de sinalização notch induzida pela crista neural durante a passagem pelos sómitos. Os Wnts são essenciais para a manutenção do dermomiótomo e para a indução da miogénese tanto medianamente (Wnt1 e Wnt3a) como lateralmente (Wnt7a). Notem a analogia com a Drosophila onde o hedgehog e o wingless polarizam os segmentos. A indução do sindetome pelo Fgf8 do miótomo. A resegmentação do esclerótomo.

Estudo do desenvolvimento embrionário da mosca Drosophila melanogaster.

9 Maio 2023, 13:00 • João Picão Osório

Objectivos:

 - Preparação e observação de embriões de mosca para determinar os estádios de desenvolvimento.
 - Observação de expressão genética durante a embriogénese com “reporters” transgénicos fluorescentes.

Protocolo:

No lavatório (maioritariamente): colectar embriões e remoção do córion

1. Adicionar um pouco de água da torneira na placa de ágar com embriões e escovar os embriões suavemente com o pincel para ficarem em suspensão.

2. Despejar a água contendo os embriões no cesto de ovos e lavar com água destilada usando uma garrafa de esguicho para eliminar a pasta de levedura. Observar os embriões à lupa.

3. Colocar o cesto com embriões em caixas de petri com lixívia para remover o córion (esta membrana torna o embrião opaco para microscopia). Incubar ~5 min com agitação suave manual e observar periodicamente os embriões à lupa para garantir que o córion foi removido pela perda dos apêndices dorsais na grande maioria dos embriões.

Nota: é altamente recomendável o uso de bata neste passo.

4. Lavar imediatamente os embriões com água usando uma garrafa de esguicho para eliminar qualquer resíduo de lixívia.

Na bancada: montagens de embriões em laminas para microscopia

5. Colocar o cesto contendo os embriões em papel. Transferir os embriões sem córion com o pincel para uma lamina com 30μl de 50% Glicerol (ou Halocarbon oil 700), meio de montagem.

6. Espaçar os embriões com uma agulha de dissecação ou palito e colocar gentilmente uma lamela por em cima. Caso o meio de montagem não cubra toda a lamela, adicionar mais meio com uma micropipeta entre a lâmina e lamela. Selar a lamela com verniz das unhas.

Unidade de Microscopia (sala 2.1.15)

7. Levar as lâminas com os embriões para a Unidade de Microscopia, observa-los nos microscópios de fluorescência e fazer a aquisição de imagens com ajuda do técnico de microscopia Luís Marques.

Estudo do desenvolvimento embrionário da mosca Drosophila melanogaster.

9 Maio 2023, 08:00 • João Picão Osório

Objectivos:

 - Preparação e observação de embriões de mosca para determinar os estádios de desenvolvimento.
 - Observação de expressão genética durante a embriogénese com “reporters” transgénicos fluorescentes.

Protocolo:

No lavatório (maioritariamente): colectar embriões e remoção do córion

1. Adicionar um pouco de água da torneira na placa de ágar com embriões e escovar os embriões suavemente com o pincel para ficarem em suspensão.

2. Despejar a água contendo os embriões no cesto de ovos e lavar com água destilada usando uma garrafa de esguicho para eliminar a pasta de levedura. Observar os embriões à lupa.

3. Colocar o cesto com embriões em caixas de petri com lixívia para remover o córion (esta membrana torna o embrião opaco para microscopia). Incubar ~5 min com agitação suave manual e observar periodicamente os embriões à lupa para garantir que o córion foi removido pela perda dos apêndices dorsais na grande maioria dos embriões.

Nota: é altamente recomendável o uso de bata neste passo.

4. Lavar imediatamente os embriões com água usando uma garrafa de esguicho para eliminar qualquer resíduo de lixívia.

Na bancada: montagens de embriões em laminas para microscopia

5. Colocar o cesto contendo os embriões em papel. Transferir os embriões sem córion com o pincel para uma lamina com 30μl de 50% Glicerol (ou Halocarbon oil 700), meio de montagem.

6. Espaçar os embriões com uma agulha de dissecação ou palito e colocar gentilmente uma lamela por em cima. Caso o meio de montagem não cubra toda a lamela, adicionar mais meio com uma micropipeta entre a lâmina e lamela. Selar a lamela com verniz das unhas.

Unidade de Microscopia (sala 2.1.15)

7. Levar as lâminas com os embriões para a Unidade de Microscopia, observa-los nos microscópios de fluorescência e fazer a aquisição de imagens com ajuda do técnico de microscopia Luís Marques.

A PL21 não tem aula prática nesta semana

9 Maio 2023, 08:00 • João Picão Osório

A BDA tem uma carga horária de aulas práticas de 2h por semana mas são lecionadas em aulas de 4h 15 em 15 dias. Sendo assim nesta data, esta turma não teve aula prática.

Aula 20

8 Maio 2023, 15:00 • Solveig Thorsteinsdottir

Continuação da aula anterior sobre a formação dos segmentos nos embriões de vertebrados. As vias Wnt e Fgf como participantes nesse output. O possível papel do Fgf8 e Wnt3a na manutenção das oscilações de expressão dos genes do relógio. O Fgf8 como um gradiente de degradação de mRNA. A frente de determinação e a entrada num ambiente sem Fgf8 (wavefront) prepara as células para a somitogénese.

 A ativação do Mesp2/Meso1 e a definição do local da fenda. A indução de EphA4 pelo Mesp2/Meso1 produz a fenda. O papel da matriz de fibronectin na epitelização dos sómitos e como estabilizador da fenda.