Analise de imagens com ImageJ

30 Março 2023, 14:00 • Federico Herrera Garcia

Nesta aula, dei aos alunos um protocolo detalhado para a análise das imagens de imunocitoquímica através do ImageJ, e disponibilizei um fórum para abordar as suas questões e dúvidas. Os estudantes tiveram que analisar a fluorescência total em 10 imagens, e a fluorescência nuclear e citosólica num mínimo de 150 células em pelo menos 3 imagens diferentes. Acompanhei-os em cada passo do protocolo e discuti as suas dificuldades, desde a análise das imagens até à apresentação dos resultados. Expliquei que os dados deveriam ser apresentados com 1) imagens representativas dos resultados da experiência; 2) gráficos de barras para a fluorescência total; e 3) box plots ou violin plots no caso da translocação de fluorescência para o núcleo. Expliquei como deviam ser analisados os dados em caso de seguir uma distribuição normal ou não normal, e como deviam ser representadas as significações nas gráficas e nas suas legendas. A aula de análise de imagem finalizou com a resolução de uma serie de problemas de imunocitoquímica.

Imunocitoquímica I: Fixação, permeabilização, bloqueio e anticorpo primário

30 Março 2023, 09:00 • Federico Herrera Garcia

Após uma breve introdução ao método de imunocitoquímica, ao protocolo e ao plano das aulas práticas, os alunos trataram as células HeLa com TNFalpha durante 15 a 120 minutos. Depois, fixaram células com metanol gelado a -20C durante 10 minutos, lavaram o excesso com PBS (3 vezes x 10 min cada) e permeabilizaram com Triton X-100 0,1% à temperatura ambiente durante 10 minutos. As amostras foram lavadas 3 vezes x 10 min cada com PBS e as amostras foram bloqueadas com Albumina de Soro Bovino a 5% durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois, os anticorpos primários contra NFkB e STAT3 foram adicionados às amostras e incubados a 4C durante a noite. Durante os tempos de incubação, expliquei mais detalhadamente os princípios subjacentes a cada etapa do protocolo, e fiz um lembrete de como e quando a etapa seguinte deveria ser levada a cabo.

Imunocitoquímica II: Anticorpos Secundários

24 Março 2023, 09:00 • Federico Herrera Garcia

Nesta etapa, os alunos só tinham de adicionar os anticorpos secundários às amostras e incubá-las à temperatura ambiente e na escuridão durante 2 horas. Resumidamente, os anticorpos primários foram lavados com 3 lavagens com PBS durante 10 min cada, os anticorpos secundários numa solução de BSA 1% foram adicionados às amostras e, após 2 horas, os anticorpos secundários foram lavados com PBS 3 vezes durante 10 min cada. As lamelas de vidro com as células foram então montadas em lâminas de vidro com meio de montagem, e seladas com verniz de unhas. Durante os tempos de incubação, expliquei em detalhe os princípios subjacentes a estas etapas e antecipei o trabalho que faríamos no microscópio no dia seguinte.

Analise de imagens com ImageJ

23 Março 2023, 14:00 • Federico Herrera Garcia

Nesta aula, dei aos alunos um protocolo detalhado para a análise das imagens de imunocitoquímica através do ImageJ, e disponibilizei um fórum para abordar as suas questões e dúvidas. Os estudantes tiveram que analisar a fluorescência total em 10 imagens, e a fluorescência nuclear e citosólica num mínimo de 150 células em pelo menos 3 imagens diferentes. Acompanhei-os em cada passo do protocolo e discuti as suas dificuldades, desde a análise das imagens até à apresentação dos resultados. Expliquei que os dados deveriam ser apresentados com 1) imagens representativas dos resultados da experiência; 2) gráficos de barras para a fluorescência total; e 3) box plots ou violin plots no caso da translocação de fluorescência para o núcleo. Expliquei como deviam ser analisados os dados em caso de seguir uma distribuição normal ou não normal, e como deviam ser representadas as significações nas gráficas e nas suas legendas. A aula de análise de imagem finalizou com a resolução de uma serie de problemas de imunocitoquímica.

Dinâmica da Localização do Factor NF-B em células HeLa estimuladas com TNF- - Western Blot (Dia 1)

23 Março 2023, 09:30 • Carlos Miguel Ribeiro da Silva Farinha

Dinâmica da Localização do Factor NF-kB 

em células HeLa estimuladas com TNF-a - Western Blot (Dia 1)