Imunocitoquímica I: Fixação, permeabilização, bloqueio e anticorpo primário

2 Março 2023, 09:00 • Federico Herrera Garcia

Após uma breve introdução ao método de imunocitoquímica, ao protocolo e ao plano das aulas práticas, os alunos trataram as células HeLa com TNFalpha durante 15 a 120 minutos. Depois, fixaram células com metanol gelado a -20C durante 10 minutos, lavaram o excesso com PBS (3 vezes x 10 min cada) e permeabilizaram com Triton X-100 0,1% à temperatura ambiente durante 10 minutos. As amostras foram lavadas 3 vezes x 10 min cada com PBS e as amostras foram bloqueadas com Albumina de Soro Bovino a 5% durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois, os anticorpos primários contra NFkB e STAT3 foram adicionados às amostras e incubados a 4C durante a noite. Durante os tempos de incubação, expliquei mais detalhadamente os princípios subjacentes a cada etapa do protocolo, e fiz um lembrete de como e quando a etapa seguinte deveria ser levada a cabo.

Preparação de soluções para western blotting e imunocitoquímica

24 Fevereiro 2023, 09:00 • Federico Herrera Garcia

Introdução á imunocitoquímica

23 Fevereiro 2023, 09:00 • Federico Herrera Garcia

Esta aula foi preparada para os estudantes compreender os princípios da imunocitoquímica. Analisei o protocolo e expliquei os princípios por detrás de cada passo, e forneci materiais em linha adicionais para estudar mais a fundo. Os princípios de fluorescência, comprimentos de onda e propriedades óticas dos fluorocromos foram relembrados. Os estudantes fizeram uma série de problemas em aula.

 Recursos:

Methods based on antibodies (documents for reading):

https://www.abcam.com/protocols/antibody-methods-and-techniques

https://link.springer.com/content/pdf/10.1007%2F0-387-22845-4_4.pdf

Immunocytochemistry vs Immunohistochemistry:

https://en.wikipedia.org/wiki/Immunocytochemistry

Secondary antibodies (Thermo Fisher)(1:20 min):

https://www.thermofisher.com/pt/en/home/life-science/antibodies/antibodies-learning-center/antibodies-resource-library/antibody-methods/introduction-secondary-antibodies.html#video

Immunocytochemistry (plus explicações de monoclonal vs polyclonal antibodies)(12:28 min):

https://youtu.be/7RT02cmZoPQ

Immunohistochemistry (also valid for Immunocytochemistry)(5:30 min): https://youtu.be/zO70nrWcAyk

Indirect Immunofluorescence (applicable to ICC/IHC and ELISA)(from min 4:45 to min 12:00): https://youtu.be/mvI257AbDOE

Frank Lectures. A little robotic, and sometimes redundant, but illustrative:

Primary and secondary antibodies (6:48):  https://youtu.be/qQ0BaZ83ZtY 

Apresentação

16 Fevereiro 2023, 14:30 • Carlos Miguel Ribeiro da Silva Farinha

Apresentação Bloco Western Blot