Conectando o sistema visual - II

29 Março 2023, 17:00 • Alisson Marques de Miranda Cabral Gontijo

Conectando o sistema visual - II

Interligação do sistema visual - I

27 Março 2023, 16:30 • Alisson Marques de Miranda Cabral Gontijo

Interligação do sistema visual - I

Sistema sensorial: comportamento de evasão à luz (I)

27 Março 2023, 10:00 • Alisson Marques de Miranda Cabral Gontijo

Sistema sensorial: comportamento de evasão à luz (I) 

Os experimentos desta aula abordaram o sistema de visão da larva de Drosophila, o comportamento inato larval de evasão à luz, circuitos neuronais, a neuromodulação por neuropeptídeos, e diferentes técnicas neurogenéticas para manipulação da atividade neuronal. 

Larvas de Drosophila vivem na comida e apresentam um comportamento de aversão à luz ambiente, durante o estádio larval. Como é que a larva sente a luz ambiente e que tipo de processamento neuronal ocorre para que a larva transforme essa deteção num comportamento locomotor, que resulta na preferência pela escuridão? Para demonstrar algumas propriedades desse sistema visual e comportamental, estudamos os componentes da via sensorial periférica e central larval que participa da fototransdução.

A luz é percebida por, pelo menos, quatro vias na larva da Drosophila: 1) por células fotorrecetoras do órgão de Bowlig (o “olho” primitivo da larva da Drosophila, que se encontra na parte anterior da larva acoplado ao esqueleto céfalo-faríngeo), 2-3) por duas vias independentes de neurónios multidendríticos da cutícula (neurónios Classe IV e neurónios traqueais v’td2), e, finalmente, 4) por neurónios “pacemakers” no sistema nervoso central que modulam o ciclo circadiano. Nesta aula estudamos as três primeiras vias (1-3). 

Nesta aula alteramos algumas destas populações neuronais utilizando diferentes ferramentas da neurogenética, como transgenes e mutações. Utilizamos o sistema GAL4-UAS para expressar diferentes transgenes para causar a morte ou o silenciamento de diferentes populações neuronais.

Nomeadamente estudamos duas populações neuronais que representam duas das vias sensíveis à luz ambiente: as células fotorrecetoras no órgão de Bowlig, marcadas pelo driver strong Glass-multimer reporter-GAL4 (sGMR-GAL4 ou GMR-GAL4) e as células multidendríticas multissensoriais da cutícula (Classe IV) marcadas pelo driver pickpocket-GAL4 (ppk-GAL4).

Para induzir a morte das células neuronais alvo, utilizamos o gene pró-apóptico da Drosophila, reaper (rpr), que promove apoptose (morte celular programada dependente da ativação de Caspases) em Drosophila.

Para o silenciamento neuronal, utilizamos duas vias: a hiperpolarização e o bloqueio da exocitose, através da expressão do canal de potássio do retificador interno (Kir2.1)) e da cadeia leve da toxina tetânica (TxT), respectivamente. O Kir2.1 aumenta a condutância da membrana a iões de potássio, reduzindo a concentração de potássio intracelular, levando a uma hiperpolarização da célula. Isso contrapõe a transmissão de potenciais excitatórios ou de ação. A TxT cliva a sinaptobrevina, uma proteína do complexo SNARE, que é necessário por exemplo para a fusão da vesícula sináptica com a membrana plasmática durante a exocitose para a libertação de neurotransmissores. Assim, ocorre o bloqueio da transmissão sináptica.

Nesta aula também observamos como um neuropeptídeo, a proteína Insulin-like peptide 7 (Ilp7), que modula a via da fototransdução das células da cutícula (maioritariamente em resposta aos neurónios v’td2) ao nível do sistema nervoso central pode ser crucial para o comportamento inato do animal em resposta à luz. O neuropeptídeo Ilp7 é uma relaxina da superfamília dos peptídeos similares à insulina. A relaxina é uma família conservada de peptídeos que ativa recetores acoplados a proteína G (GPCRs). O Ilp7 ativa o recetor Lgr4. A Ilp7 é expressa em interneurónios da corda ventral neural (VNC) larval e sua atividade modulatória é necessária especialmente em neurónios dorsais chamados “Dp7” para o comportamento de aversão à luz. Os neurónios Dp7 recebem informação direta dos neurónios v’td2 da cutícula, ambos os quais se despolarizam em resposta à luz. O Ilp7 libertado dos neurónios Dp7 modula a atividade de neurónios abdominais (positivos para os seu recetor Lgr4+ e marcado pela proteína Lk (ABLK, abdominal Leukokinin neurons)) que são críticos para o comportamento locomotor de aversão à luz. Nesta aula observamos o que ocorre quando um animal não possui o gene que codifica para a proteína Ilp7 (ilp7[1] é um knock-out (KO) para o gene ilp7 e está no background gentético w[1118]).

Os grupos utilizaram arenas de opção (luz ambiente (200-2000 lux) vs. escuridão) para analisar a preferência das larvas dos seguintes genótipos:

w[1118]

w[1118]; ilp7[1]

GMR>rpr (sGMR-GAL4, UAS-rpr)

GMR>Kir2.1 (sGMR-GAL4, UAS-Kir2.1)

ppk>Kir2.1 (ppk-GAL4,  UAS-Kir2.1)

ppk>txt (ppk-GAL4,  UAS-TxT)

Os animais foram condicionados no escuro 5 min antes do ensaio. Após 10 min, os alunos quantificaram quantos animais estavam em cada parte da arena e preencheram uma tabela para análise na próxima aula. Foi feita a redação do relatório e entrega do relatório. Esta aula contou com a colaboração da Dra. Fabiana Herédia na realização da prática.

Sistema sensorial: comportamento de evasão à luz (I)

27 Março 2023, 08:00 • Alisson Marques de Miranda Cabral Gontijo

Sistema sensorial: comportamento de evasão à luz (I) 

Os experimentos desta aula abordaram o sistema de visão da larva de Drosophila, o comportamento inato larval de evasão à luz, circuitos neuronais, a neuromodulação por neuropeptídeos, e diferentes técnicas neurogenéticas para manipulação da atividade neuronal. 

Larvas de Drosophila vivem na comida e apresentam um comportamento de aversão à luz ambiente, durante o estádio larval. Como é que a larva sente a luz ambiente e que tipo de processamento neuronal ocorre para que a larva transforme essa deteção num comportamento locomotor, que resulta na preferência pela escuridão? Para demonstrar algumas propriedades desse sistema visual e comportamental, estudamos os componentes da via sensorial periférica e central larval que participa da fototransdução.

A luz é percebida por, pelo menos, quatro vias na larva da Drosophila: 1) por células fotorrecetoras do órgão de Bowlig (o “olho” primitivo da larva da Drosophila, que se encontra na parte anterior da larva acoplado ao esqueleto céfalo-faríngeo), 2-3) por duas vias independentes de neurónios multidendríticos da cutícula (neurónios Classe IV e neurónios traqueais v’td2), e, finalmente, 4) por neurónios “pacemakers” no sistema nervoso central que modulam o ciclo circadiano. Nesta aula estudamos as três primeiras vias (1-3). 

Nesta aula alteramos algumas destas populações neuronais utilizando diferentes ferramentas da neurogenética, como transgenes e mutações. Utilizamos o sistema GAL4-UAS para expressar diferentes transgenes para causar a morte ou o silenciamento de diferentes populações neuronais.

Nomeadamente estudamos duas populações neuronais que representam duas das vias sensíveis à luz ambiente: as células fotorrecetoras no órgão de Bowlig, marcadas pelo driver strong Glass-multimer reporter-GAL4 (sGMR-GAL4 ou GMR-GAL4) e as células multidendríticas multissensoriais da cutícula (Classe IV) marcadas pelo driver pickpocket-GAL4 (ppk-GAL4).

Para induzir a morte das células neuronais alvo, utilizamos o gene pró-apóptico da Drosophila, reaper (rpr), que promove apoptose (morte celular programada dependente da ativação de Caspases) em Drosophila.

Para o silenciamento neuronal, utilizamos duas vias: a hiperpolarização e o bloqueio da exocitose, através da expressão do canal de potássio do retificador interno (Kir2.1)) e da cadeia leve da toxina tetânica (TxT), respectivamente. O Kir2.1 aumenta a condutância da membrana a iões de potássio, reduzindo a concentração de potássio intracelular, levando a uma hiperpolarização da célula. Isso contrapõe a transmissão de potenciais excitatórios ou de ação. A TxT cliva a sinaptobrevina, uma proteína do complexo SNARE, que é necessário por exemplo para a fusão da vesícula sináptica com a membrana plasmática durante a exocitose para a libertação de neurotransmissores. Assim, ocorre o bloqueio da transmissão sináptica.

Nesta aula também observamos como um neuropeptídeo, a proteína Insulin-like peptide 7 (Ilp7), que modula a via da fototransdução das células da cutícula (maioritariamente em resposta aos neurónios v’td2) ao nível do sistema nervoso central pode ser crucial para o comportamento inato do animal em resposta à luz. O neuropeptídeo Ilp7 é uma relaxina da superfamília dos peptídeos similares à insulina. A relaxina é uma família conservada de peptídeos que ativa recetores acoplados a proteína G (GPCRs). O Ilp7 ativa o recetor Lgr4. A Ilp7 é expressa em interneurónios da corda ventral neural (VNC) larval e sua atividade modulatória é necessária especialmente em neurónios dorsais chamados “Dp7” para o comportamento de aversão à luz. Os neurónios Dp7 recebem informação direta dos neurónios v’td2 da cutícula, ambos os quais se despolarizam em resposta à luz. O Ilp7 libertado dos neurónios Dp7 modula a atividade de neurónios abdominais (positivos para os seu recetor Lgr4+ e marcado pela proteína Lk (ABLK, abdominal Leukokinin neurons)) que são críticos para o comportamento locomotor de aversão à luz. Nesta aula observamos o que ocorre quando um animal não possui o gene que codifica para a proteína Ilp7 (ilp7[1] é um knock-out (KO) para o gene ilp7 e está no background gentético w[1118]).

Os grupos utilizaram arenas de opção (luz ambiente (200-2000 lux) vs. escuridão) para analisar a preferência das larvas dos seguintes genótipos:

w[1118]

w[1118]; ilp7[1]

GMR>rpr (sGMR-GAL4, UAS-rpr)

GMR>Kir2.1 (sGMR-GAL4, UAS-Kir2.1)

ppk>Kir2.1 (ppk-GAL4,  UAS-Kir2.1)

ppk>txt (ppk-GAL4,  UAS-TxT)

Os animais foram condicionados no escuro 5 min antes do ensaio. Após 10 min, os alunos quantificaram quantos animais estavam em cada parte da arena e preencheram uma tabela para análise na próxima aula. Foi feita a redação do relatório e entrega do relatório. Esta aula contou com a colaboração da Dra. Fabiana Herédia na realização da prática.

Visão III

22 Março 2023, 17:00 • Alisson Marques de Miranda Cabral Gontijo

Visão III