Neurodegeneração: indução da doença de Parkinson em Drosophila melanogaster (II)

17 Abril 2023, 08:00 • João Picão Osório

Na aula passada tivemos uma introdução e discussão sobre neurodegeneração: i) noções gerais de neurodegeneração em Humanos, ii) características moleculares, celulares e comportamentais da doença de Parkinson (DP), iii) papel da α-sinucleína na DP, e iv) estudo da DP em mosca. Neste último ponto, para induzirmos a DP em mosca fizemos cruzamentos com linhas transgénicas para sobre-expressar α-sinucleína Humana em todos os neurónios da mosca (57C10 > α-Syn) e avaliar o seu impacto comportamental ao longo do tempo. Para tal, ao longo das próximas aulas iremos quantificar o desempenho motor na descendência dos cruzamentos efectuados com ensaio de escalada (climbing assay) que tiram proveito da forte geotaxia negativa comportamental em Drosophila. Este ensaio mede a capacidade de as moscas subirem a parede de um tubo em função da idade. Iremos realizar estes ensaios em moscas controle (pBDP > α-Syn) e tratamento (57C10 > α-Syn) em 5 condições diferentes para testar efeitos do sexo e da demografia na DP.

Olfato, gosto, audição e somatossensação II

5 Abril 2023, 17:00 • Alisson Marques de Miranda Cabral Gontijo

Olfato, gosto, audição e somatossensação II 

Conteúdo

Gosto

• Os mamíferos têm cinco modalidades de gosto básicas: amargo, doce, umami, salgado e azedo
• Doce e umami são sentidos por heterodímeros da família T1R dos recetores acoplados à proteína G
• O amargo é sentido por recetores T2R, uma família grande de recetores acoplados à proteína G
• Gostos azedo e salgado envolvem canais iónicos específicos
• Doce e amargo envolvem maioritariamente vias segregadas desde a língua até o córtex gustatório
• Os mamíferos têm cinco modalidades de gosto básicas: amargo, doce, umami, salgado e azedo

Audição

• Introdução ao sistema auditivo
• Características físicas do som
• Anatomia do sistema auditivo
• Sistema de deteção do som

Olfato, gosto, audição e somatossensação I

3 Abril 2023, 16:30 • Alisson Marques de Miranda Cabral Gontijo

Olfato, gosto, audição e somatossensação I

Conteúdo:

Olfato

Como sentimos odores?

• Ligação de moléculas odorantes (que possuem cheiro) leva à abertura de canais com portagem de cAMP nos neurónios recetores olfativos (ORNs em inglês)
• Moléculas odorantes são representadas pela ativação combinatorial dos neurónios recetores olfativos (ORNs)
• Recetores olfatórios são codificados por centenas de genes em mamíferos
• Polimorfismos em genes codificantes de recetores olfatórios contribuem para as difernças individuais na perceção dos odores
• Cada neurónio recetor olfativo (ORN) expressa um único recetor olfatório
• ORNs expressando o mesmo recetor olfatório projetam os seus axónios para o mesmo glomérulo
• Circúitos do bulbo olfatório transformam representações de odores por inibição lateral
• Inputs olfatórios são organizados diferencialmente em diferentes regiões corticais

• C. elegans codifica escolhas comportamentais odoríferas ao nível do neurónio sensorial
• Os neurónios sensoriais do C. elegans são ativados pela remoção do odorante e conectam-se com vias ON e OFF
• Os sistemas olfatórios dos insetos e dos mamíferos compartilham muitas similaridades
• O lóbulo da antenna transforma o input dos neurónios recetores olfativos para sua representação mais eficiente por neurónios de projeção
• Odores com significância comportamental inata usam canais olfatórios dedicados
• Representações de odores nos centros de maior ordem para comportamentos inatos e aprendidos são estereotipados e estocásticos, respetivamente

Sistema sensorial: comportamento de evasão à luz (II) e Neurodegeneração (I)

3 Abril 2023, 10:00 • João Picão Osório

Sistema sensorial: comportamento de evasão à luz (II) e Neurodegeneração (I)

Aula composta por duas partes: 1) a 2a parte da aula V « Sistema sensorial : comportamento de evasão à luz (II) » iniciada no dia 27/03/2023 ; e 2) A introdução ao bloco « Neurodegeneração ». Um bloco de múltiplas aulas.

Parte 1 : Sistema sensorial: comportamento de evasão à luz (II)

Na aula passada manipulamos diferentes vias sensoriais da larva da Drosophila melanogaster que são sensíveis à luz: 1) a via do órgão de Bowlig (utilizando sGMR-GAL4), 2) a via das células multidendríticas sensoriais ppk (utilizando ppk-GAL4), e 3) a via das células sensoriais multidendríticas traqueais v’td2-Dp7 (utilizando uma mutação, ilp7[1]). Utilizamos UAS-rpr para eliminar as células por apoptose. Utilizamos também Kir2.1 e a toxina do tétano (TxT) para silenciar os neurónios por hiperpolarização ou por bloqueio da via da exocitose, respetivamente. Quantificamos a preferência das larvas por escuridão ou luz ambiente após 10 min num ensaio simples de opção. As larvas foram condicionadas por pelo menos 5 min no escuro antes do ensaio. Nesta aula analisamos os resultados separados por grupos e comparamos os resultados com resultados de outras publicações. Após a discussão dos resultados na aula os alunos receberam um questionário com 5 perguntas em forma de peer-review sobre os experimentos realizados. Esse foi o relatório desta aula.

Parte 2: Neurodegeneração (I)

Na segunda etapa desta aula foi feita primeiro a introdução e discussão interativa sobre os temas dos trabalhos a serem apresentados na última aula. Em seguida foi feita a introdução ao tema das aulas seguintes “Neurodegeneração: indução da doença de Parkinson em Drosophila melanogaster”, com o enfoque na doença de Parkinson e o papel da alfa-sinucleína nesta doença.

Finalmente, nesta primeira aula os alunos fizeram os cruzamentos com moscas transgénicas para estudarem um modelo da “doença de Parkinson” na descendência da mosca. Para tal, utilizaram o sistema GAL4/UAS para expressar a alfa-sinucleína humana em todos os neurónios da mosca com as seguintes linhas transgénicas:

-  Driver pan-neuronal 57C10-GAL4 : w¹¹¹⁸; ; P{GMR57C10-GAL4}attP2 

- Driver vazio como controlo pBDP-GAL4: w¹¹¹⁸; ; P{pBDP-GAL4}attP2

- α-sinucleína humana UAS-α-Syn: w[1118];; P{w[+mC]=UAS-SNCA.J}7/TM3, Sb[1]

Procedimento

Cada grupo efectuou dois cruzamentos por cada driver/α-Syn num total de 4 cruzamentos.

1) Combinaram os dois tubos de virgens 57C10-GAL4 com os dois tubos de machos UAS-α-Syn; 

2) Combinaram dois tubos de virgens pBp-GAL4 com dois tubos de machos UAS-α-Syn;

3) Depois de combinarem as moscas no cruzamento, identificaram os tubos com os respetivos genótipos parentais, data, o grupo, e a turma.

Esta aula foi ministrada pelos professores Alisson Gontijo e João Picão

Sistema sensorial: comportamento de evasão à luz (II) e Neurodegeneração (I)

3 Abril 2023, 08:00 • Alisson Marques de Miranda Cabral Gontijo

Sistema sensorial: comportamento de evasão à luz (II) e Neurodegeneração (I)

Aula composta por duas partes: 1) a 2a parte da aula V « Sistema sensorial : comportamento de evasão à luz (II) » iniciada no dia 27/03/2023 ; e 2) A introdução ao bloco « Neurodegeneração ». Um bloco de múltiplas aulas.

Parte 1 : Sistema sensorial: comportamento de evasão à luz (II)

Na aula passada manipulamos diferentes vias sensoriais da larva da Drosophila melanogaster que são sensíveis à luz: 1) a via do órgão de Bowlig (utilizando sGMR-GAL4), 2) a via das células multidendríticas sensoriais ppk (utilizando ppk-GAL4), e 3) a via das células sensoriais multidendríticas traqueais v’td2-Dp7 (utilizando uma mutação, ilp7[1]). Utilizamos UAS-rpr para eliminar as células por apoptose. Utilizamos também Kir2.1 e a toxina do tétano (TxT) para silenciar os neurónios por hiperpolarização ou por bloqueio da via da exocitose, respetivamente. Quantificamos a preferência das larvas por escuridão ou luz ambiente após 10 min num ensaio simples de opção. As larvas foram condicionadas por pelo menos 5 min no escuro antes do ensaio. Nesta aula analisamos os resultados separados por grupos e comparamos os resultados com resultados de outras publicações. Após a discussão dos resultados na aula os alunos receberam um questionário com 5 perguntas em forma de peer-review sobre os experimentos realizados. Esse foi o relatório desta aula.

Parte 2: Neurodegeneração (I)

Na segunda etapa desta aula foi feita primeiro a introdução e discussão interativa sobre os temas dos trabalhos a serem apresentados na última aula. Em seguida foi feita a introdução ao tema das aulas seguintes “Neurodegeneração: indução da doença de Parkinson em Drosophila melanogaster”, com o enfoque na doença de Parkinson e o papel da alfa-sinucleína nesta doença.

Finalmente, nesta primeira aula os alunos fizeram os cruzamentos com moscas transgénicas para estudarem um modelo da “doença de Parkinson” na descendência da mosca. Para tal, utilizaram o sistema GAL4/UAS para expressar a alfa-sinucleína humana em todos os neurónios da mosca com as seguintes linhas transgénicas:

-  Driver pan-neuronal 57C10-GAL4 : w¹¹¹⁸; ; P{GMR57C10-GAL4}attP2 

- Driver vazio como controlo pBDP-GAL4: w¹¹¹⁸; ; P{pBDP-GAL4}attP2

- α-sinucleína humana UAS-α-Syn: w[1118];; P{w[+mC]=UAS-SNCA.J}7/TM3, Sb[1]

Procedimento

Cada grupo efectuou dois cruzamentos por cada driver/α-Syn num total de 4 cruzamentos.

1) Combinaram os dois tubos de virgens 57C10-GAL4 com os dois tubos de machos UAS-α-Syn; 

2) Combinaram dois tubos de virgens pBp-GAL4 com dois tubos de machos UAS-α-Syn;

3) Depois de combinarem as moscas no cruzamento, identificaram os tubos com os respetivos genótipos parentais, data, o grupo, e a turma.

Esta aula foi ministrada pelos professores Alisson Gontijo e João Picão