Sumários

Microscopia de fluorescência

27 Fevereiro 2025, 09:00 • Federico Herrera Garcia

No segmento de microscopia, o objetivo era visualizar a localização de proteínas de interesse (e.g., STAT3 e mutantes) em células HeLa, recorrendo a marcação fluorescente.

Preparação das amostras:
Mais uma vez, existiam grupos de células não tratadas e tratadas com LIF (100 ng/mL). Após o tratamento, o meio foi decantado e as células foram lavadas duas vezes com PBS.
Fixação:
Adicionou-se metanol frio (-20°C) às células para fixação, mantendo as placas no congelador durante 10 minutos.
Lavagens e coloração nuclear (opcional):
Após remover totalmente o metanol, as células foram lavadas com PBS. Se desejado, realizou-se coloração dos núcleos com DAPI, incubando 5 minutos no escuro e lavando novamente com PBS.
Preparação final:
Após a última lavagem, as amostras estavam prontas para observação no microscópio de fluorescência, sendo organizadas as sessões de aquisição por grupos e horários previamente estipulados.

Microscopia de fluorescência

21 Fevereiro 2025, 14:00 • Federico Herrera Garcia

No segmento de microscopia, o objetivo era visualizar a localização de proteínas de interesse (e.g., STAT3 e mutantes) em células HeLa, recorrendo a marcação fluorescente.

Preparação das amostras:
Mais uma vez, existiam grupos de células não tratadas e tratadas com LIF (100 ng/mL). Após o tratamento, o meio foi decantado e as células foram lavadas duas vezes com PBS.
Fixação:
Adicionou-se metanol frio (-20°C) às células para fixação, mantendo as placas no congelador durante 10 minutos.
Lavagens e coloração nuclear (opcional):
Após remover totalmente o metanol, as células foram lavadas com PBS. Se desejado, realizou-se coloração dos núcleos com DAPI, incubando 5 minutos no escuro e lavando novamente com PBS.
Preparação final:
Após a última lavagem, as amostras estavam prontas para observação no microscópio de fluorescência, sendo organizadas as sessões de aquisição por grupos e horários previamente estipulados.

Microscopia de fluorescência

21 Fevereiro 2025, 09:00 • Federico Herrera Garcia

No segmento de microscopia, o objetivo era visualizar a localização de proteínas de interesse (e.g., STAT3 e mutantes) em células HeLa, recorrendo a marcação fluorescente.

Preparação das amostras:
Mais uma vez, existiam grupos de células não tratadas e tratadas com LIF (100 ng/mL). Após o tratamento, o meio foi decantado e as células foram lavadas duas vezes com PBS.
Fixação:
Adicionou-se metanol frio (-20°C) às células para fixação, mantendo as placas no congelador durante 10 minutos.
Lavagens e coloração nuclear (opcional):
Após remover totalmente o metanol, as células foram lavadas com PBS. Se desejado, realizou-se coloração dos núcleos com DAPI, incubando 5 minutos no escuro e lavando novamente com PBS.
Preparação final:
Após a última lavagem, as amostras estavam prontas para observação no microscópio de fluorescência, sendo organizadas as sessões de aquisição por grupos e horários previamente estipulados.

Introdução Unidade Curricular

20 Fevereiro 2025, 14:00 • Federico Herrera Garcia

Nesta aula foi introduzida a estrutura, organização e calendarização da unidade curricular de Bioquímica Experimental IV, e avançámos nas técnicas experimentais fundamentais para a análise quantitativa e funcional de proteínas em biologia molecular e celular, relevantes para o estudo de modificações pós-traducionais, sinalização e expressão proteica, com foco em Western Blotting, imunoprecipitação, citometria de fluxo e microscopia de fluorescência.

1. Western Blotting: princípios e aplicações

Técnicas para separação proteica por SDS-PAGE em função do peso molecular, transferindo as proteínas do gel para uma membrana (normalmente PVDF).
Imunodetecção com anticorpos específicos contra os alvos, usando métodos diretos ou indiretos (anticorpos primários e secundários marcados com enzimas como HRP).
Análise visual da presença, quantidade relativa e resolução de isoformas proteicas e modificações, por exemplo, diferenciar formas fosforiladas.
Método altamente sensível para validar a efetividade da transfeção, o nível de expressão das versões mutantes do STAT3, e para estudos de sinalização.

2. Imunoprecipitação (IP)

Técnica para isolamento seletivo de proteínas ou complexos proteicos a partir de soluções celulares, usando anticorpos específicos ligados a esferas de agarose ou poliacrilamida.
Permite purificação parcial e concentração do antigénio para análises posteriores, incluindo Western Blot e identificação de modificações ou interações.
Explicação detalhada do procedimento: lise da célula, incubação com anticorpos, captura por esferas, lavagem e eluição do complexo para análise.

3. Citometria de Fluxo

Método que permite a análise rápida e quantitativa de múltiplas propriedades celulares em suspensão, medindo luz dispersa (tamanho e complexidade) e fluorescência associada a marcadores específicos.
Aplicações na quantificação do nível de fosforilação do STAT3 em células HeLa modificadas para diferentes mutantes e tratamento com citocinas (ex.: LIF).
Utilização de anticorpos conjugados com fluorocromos (ex.: Alexa Fluor 647) para detecção direta dos alvos, com aquisição e análise de dados usando softwares como Floireada.io.
Demonstração prática de como analisar e interpretar dados de citometria de fluxo para estudos funcionais.

4. Microscopia de Fluorescência

Técnica para visualização celular direta da localização e dinâmica de proteínas marcadas com proteínas fluorescentes (ex.: Venus), usando microscópios de fluorescência widefield e confocal.
Procedimentos de fixação e permeabilização para preservar a arquitetura celular e permitir o acesso dos anticorpos (no caso de imunomarcação).
Aquisição robusta de imagens que permitem avaliar a translocação nuclear do STAT3 e outras alterações subcelulares em resposta a estímulos.
Ferramentas digitais para análise de imagem (ImageJ/FIJI) para quantificação precisa da intensidade e localização de fluorescência.

5. Preparação e processamento das amostras

Enfaixámos a importância da correta preparação das células para essas técnicas: semeadura, transfecção, fixação (com agentes químicos como formaldeído), bloqueio, permeabilização e incubação com anticorpos.
Permeabilização cuidadosa (usando detergentes suaves como NP-40) é essencial para manter a integridade celular mantendo a acessibilidade de antígenos.

6. Controlo de qualidade e análise dos dados

Destaque para o uso de controles apropriados nos ensaios, como anticorpos isótipos, amostras não tratadas e replicados.
Apresentação e discussão das melhores práticas para a representação gráfica dos resultados, incluindo uso correcto de escalas, legendas claras e análises estatísticas adequadas.

7. Integração das técnicas na investigação

Estas técnicas integradas permitem caracterizar a funcionalidade das proteínas mutantes, a sua localização, o nível de modificação pós-traducional (ex.: fosforilação em Y705 e S727 do STAT3) e a capacidade de sinalização.
Fornecem dados complementares entre si: Western Blot para análise proteica, IP para purificação e estudo de interações, citometria para análise em populações celulares e microscopia para visualização subcelular.

Microscopia de fluorescência

20 Fevereiro 2025, 09:00 • Federico Herrera Garcia

No segmento de microscopia, o objetivo era visualizar a localização de proteínas de interesse (e.g., STAT3 e mutantes) em células HeLa, recorrendo a marcação fluorescente.

Preparação das amostras:
Mais uma vez, existiam grupos de células não tratadas e tratadas com LIF (100 ng/mL). Após o tratamento, o meio foi decantado e as células foram lavadas duas vezes com PBS.
Fixação:
Adicionou-se metanol frio (-20°C) às células para fixação, mantendo as placas no congelador durante 10 minutos.
Lavagens e coloração nuclear (opcional):
Após remover totalmente o metanol, as células foram lavadas com PBS. Se desejado, realizou-se coloração dos núcleos com DAPI, incubando 5 minutos no escuro e lavando novamente com PBS.
Preparação final:
Após a última lavagem, as amostras estavam prontas para observação no microscópio de fluorescência, sendo organizadas as sessões de aquisição por grupos e horários previamente estipulados.