Sumários

Citometria de Fluxo

21 Março 2025, 14:00 • Federico Herrera Garcia

Nesta sessão, as equipas trabalharam com células HeLa previamente transfectadas com os plasmídeos de interesse. O objetivo era medir, por citometria de fluxo, a fosforilação de STAT3 em resposta ao tratamento com LIF.

  1. Preparação dos grupos e condições experimentais:
    Havia dois conjuntos de placas: um com células não tratadas (controlo negativo), outro com células tratadas com LIF (100 ng/mL) para ativação da via de sinalização. Após 10 minutos de incubação a 37°C, prepararam-se tubos microcentrífuga para cada condição experimental.

  2. Colheita e preparação das células:
    Decantou-se o meio, fez-se uma lavagem rápida com PBS e adicionou-se tripsina para descolar as células. Após incubação e inativação da tripsina com meio com soro, o conteúdo de cada placa foi transferido para tubos identificados, seguido de centrifugação.

  3. Lavagens e fixação:
    As células foram lavadas em PBS e depois fixadas com paraformaldeído a 1% por 10 minutos à temperatura ambiente, protegendo da luz. A partir deste ponto, foi importante garantir que as células permaneciam em suspensão individualizada.

  4. Permeabilização e marcação:
    Após mais lavagens, as células foram permeabilizadas com Triton-X 0,1% durante 10 minutos. Posteriormente, incubaram-se com o anticorpo específico contra STAT3 fosforilado (pY705-STAT3) conjugado com Alexa Fluor 647, durante 30 minutos no escuro.

  5. Passos finais:
    Lavou-se novamente as células e finalmente estas ficaram prontas, suspensas em PBS, para aquisição no citómetro de fluxo, onde seriam analisados os níveis de fluorescência correspondentes à fosforilação de STAT3 em cada condição.

DINÂMICA DA MODIFICAÇÃO PÓS-TRADUCIONAL E LOCALIZAÇÃO SUBCELULAR DO FACTOR DE TRANSCRIÇÃO STAT3 EM CÉLULAS HELA ESTIMULADAS COM LIF

21 Março 2025, 09:00 • Ines Pankonien

Dia 1 – Extração e Quantificação de Proteínas

 

Separação de proteínas citosólicas e nucleares de células HeLa que expressam diferentes variantes de STAT3, tratadas ou não com LIF (100 ng/mL), para análise das modificações pós-traducionais e da localização do STAT3.

·      Extração fracionada de proteínas do citoplasma e do núcleo.

·      Quantificação de proteínas utilizando o método de Bradford, baseado na ligação do corante Azul Brilhante de Coomassie às proteínas e leitura da absorvância a 595 nm.

·      Preparação de géis de poliacrilamida a 10% (SDS-PAGE). 

Citometria de Fluxo

20 Março 2025, 14:00 • Federico Herrera Garcia

Nesta sessão, as equipas trabalharam com células HeLa previamente transfectadas com os plasmídeos de interesse. O objetivo era medir, por citometria de fluxo, a fosforilação de STAT3 em resposta ao tratamento com LIF.

  1. Preparação dos grupos e condições experimentais:
    Havia dois conjuntos de placas: um com células não tratadas (controlo negativo), outro com células tratadas com LIF (100 ng/mL) para ativação da via de sinalização. Após 10 minutos de incubação a 37°C, prepararam-se tubos microcentrífuga para cada condição experimental.

  2. Colheita e preparação das células:
    Decantou-se o meio, fez-se uma lavagem rápida com PBS e adicionou-se tripsina para descolar as células. Após incubação e inativação da tripsina com meio com soro, o conteúdo de cada placa foi transferido para tubos identificados, seguido de centrifugação.

  3. Lavagens e fixação:
    As células foram lavadas em PBS e depois fixadas com paraformaldeído a 1% por 10 minutos à temperatura ambiente, protegendo da luz. A partir deste ponto, foi importante garantir que as células permaneciam em suspensão individualizada.

  4. Permeabilização e marcação:
    Após mais lavagens, as células foram permeabilizadas com Triton-X 0,1% durante 10 minutos. Posteriormente, incubaram-se com o anticorpo específico contra STAT3 fosforilado (pY705-STAT3) conjugado com Alexa Fluor 647, durante 30 minutos no escuro.

  5. Passos finais:
    Lavou-se novamente as células e finalmente estas ficaram prontas, suspensas em PBS, para aquisição no citómetro de fluxo, onde seriam analisados os níveis de fluorescência correspondentes à fosforilação de STAT3 em cada condição.

Citometria de Fluxo

20 Março 2025, 09:00 • Federico Herrera Garcia

Nesta sessão, as equipas trabalharam com células HeLa previamente transfectadas com os plasmídeos de interesse. O objetivo era medir, por citometria de fluxo, a fosforilação de STAT3 em resposta ao tratamento com LIF.

  1. Preparação dos grupos e condições experimentais:
    Havia dois conjuntos de placas: um com células não tratadas (controlo negativo), outro com células tratadas com LIF (100 ng/mL) para ativação da via de sinalização. Após 10 minutos de incubação a 37°C, prepararam-se tubos microcentrífuga para cada condição experimental.

  2. Colheita e preparação das células:
    Decantou-se o meio, fez-se uma lavagem rápida com PBS e adicionou-se tripsina para descolar as células. Após incubação e inativação da tripsina com meio com soro, o conteúdo de cada placa foi transferido para tubos identificados, seguido de centrifugação.

  3. Lavagens e fixação:
    As células foram lavadas em PBS e depois fixadas com paraformaldeído a 1% por 10 minutos à temperatura ambiente, protegendo da luz. A partir deste ponto, foi importante garantir que as células permaneciam em suspensão individualizada.

  4. Permeabilização e marcação:
    Após mais lavagens, as células foram permeabilizadas com Triton-X 0,1% durante 10 minutos. Posteriormente, incubaram-se com o anticorpo específico contra STAT3 fosforilado (pY705-STAT3) conjugado com Alexa Fluor 647, durante 30 minutos no escuro.

  5. Passos finais:
    Lavou-se novamente as células e finalmente estas ficaram prontas, suspensas em PBS, para aquisição no citómetro de fluxo, onde seriam analisados os níveis de fluorescência correspondentes à fosforilação de STAT3 em cada condição.

Citometria de Fluxo

14 Março 2025, 14:00 • Federico Herrera Garcia

Nesta sessão, as equipas trabalharam com células HeLa previamente transfectadas com os plasmídeos de interesse. O objetivo era medir, por citometria de fluxo, a fosforilação de STAT3 em resposta ao tratamento com LIF.

  1. Preparação dos grupos e condições experimentais:
    Havia dois conjuntos de placas: um com células não tratadas (controlo negativo), outro com células tratadas com LIF (100 ng/mL) para ativação da via de sinalização. Após 10 minutos de incubação a 37°C, prepararam-se tubos microcentrífuga para cada condição experimental.

  2. Colheita e preparação das células:
    Decantou-se o meio, fez-se uma lavagem rápida com PBS e adicionou-se tripsina para descolar as células. Após incubação e inativação da tripsina com meio com soro, o conteúdo de cada placa foi transferido para tubos identificados, seguido de centrifugação.

  3. Lavagens e fixação:
    As células foram lavadas em PBS e depois fixadas com paraformaldeído a 1% por 10 minutos à temperatura ambiente, protegendo da luz. A partir deste ponto, foi importante garantir que as células permaneciam em suspensão individualizada.

  4. Permeabilização e marcação:
    Após mais lavagens, as células foram permeabilizadas com Triton-X 0,1% durante 10 minutos. Posteriormente, incubaram-se com o anticorpo específico contra STAT3 fosforilado (pY705-STAT3) conjugado com Alexa Fluor 647, durante 30 minutos no escuro.

  5. Passos finais:
    Lavou-se novamente as células e finalmente estas ficaram prontas, suspensas em PBS, para aquisição no citómetro de fluxo, onde seriam analisados os níveis de fluorescência correspondentes à fosforilação de STAT3 em cada condição.