Sumários

Desenho Experimental e Ferramentas Moleculares – Plasmídeos de Expressão e Mutagénese Dirigida

6 Março 2025, 14:00 • Federico Herrera Garcia

Nesta aula, abordámos os conceitos e práticas essenciais para o desenho de ferramentas moleculares que permitem a expressão, visualização e manipulação funcional de proteínas em células de mamíferos, focando especificamente na construção de plasmídeos de proteínas de fusão, e na mutagénese dirigida para estudar modificações pós-traducionais.

1. Objetivos gerais e produtos finais pretendidos

Produzir plasmídeos para expressão em células de mamíferos, onde proteínas de interesse são fusionadas com proteínas fluorescentes (como mCherry ou Venus), permitindo a sua visualização em células vivas.
Gerar mutantes específicos de proteínas (exemplo: STAT3) por mutagénese dirigida para analisar o efeito de modificações pós-traducionais, como fosforilações e acetilações, no comportamento e na interação da proteína.

2. Conceitos básicos do plasmídeo de expressão

Foi explorado o mapa e componentes do plasmídeo pcDNA3.1(-), um vetor clássico de expressão em mamíferos, destacando:
- O promotor CMV, que assegura transcrição constitutiva e elevada em diversas linhas celulares.
- O local de clonagem múltipla (MCS), onde se inserem as sequências codificadoras, delimitado por locais únicos para enzimas de restrição, essenciais para estratégias de clonagem.
- Genes de resistência à ampicilina (para seleção em E. coli) e à higromicina (para seleção em células de mamíferos).
- Origem de replicação bacteriana, necessária para amplificar plasmídeos em E. coli antes da transfecção.

3. Estratégia para criação de proteínas de fusão

A proteína de interesse (por exemplo, Brawnin) é ligada ao gene da proteína fluorescente (por exemplo, mCherry), garantindo a expressão simultânea de uma proteína quimérica com funções de interesse (localização, interação) e visualização.
O codão STOP só deve estar presente no final da proteína quimérica para evitar a terminação prematura da tradução.
É imprescindível manter a grelha de leitura correta, o que implica cuidado extremo ao inserir as sequências e ai controlar os tripletes durante a clonagem (múltiplos de 3 nucleótidos).

4. Clonagem por enzimas de restrição

Explicámos o uso das enzimas de restrição para digestão tanto do plasmídeo vetor como dos fragmentos de PCR contendo as sequências de interesse.
Os primers de PCR são desenhados incluindo as sequências reconhecidas pelas enzimas de restrição desejadas (ex.: EcoRI, NotI) nas extremidades, com caudas extras para facilitar a atividade enzimática.
Após digestão enzimática, fragmentos com extremidades coesivas complementares asseguram inserção eficiente e específica nos locais desejados do plasmídeo.

5. Identificação e seleção de sequências à inserir

Orientámos sobre como identificar as sequências codificadoras de proteínas fluorescentes e proteínas de interesse em bases de dados públicas altamente confiáveis, como UniProt e FPbase.
Enfatizámos a importância de usar sequências humanas corrigidas e verificadas previamente para evitar erros no desenho.

6. Mutagénese dirigida para análise funcional

Após criar os plasmídeos com a proteína de fusão selvagem, o passo seguinte consiste em gerar mutações específicas em resíduos de modificação pós-traducional (PTMs), como fosforilações em tirosinas e serinas, ou acetilações em lisinas.
Utilizamos técnicas de PCR específicas para mutagénese dirigida onde os primers incorporam as mutações desejadas — substituindo o aminoácido alvo por um que mimetize a modificação (ex.: glutamato para fosforilação) ou bloqueie a modificação (ex.: alanina para não fosforilável).

7. Ferramentas online para desenho de primers

Foi demonstrado como usar ferramentas como o programa PrimerX para desenhar primers de mutagénese dirigidos com alta precisão, considerando a escolha das mutações e respetiva sequência do plasmídeo.
Reforçámos as regras para um bom design de primers: tamanho adequado, conteúdo GC, localização central da mutação e braços longos de complementariedade ao template plasmidial.

8. Procedimentos típicos de mutagénese

A mutagénese é realizada por PCR usando o plasmídeo parental como template, os primers mutagénicos e uma polimerase com capacidade de correção de erros (ex.: Pfu turbo).
Após a amplificação, a mistura de PCR é tratada com a enzima DpnI para eliminar o template parental metilado, selecionando apenas o DNA mutado.
O produto é então transformado em bactérias E. coli para amplificação, seguido de extração e sequenciação para confirmação da mutação.

9. Considerações gerais

Destacámos que o trabalho com estas ferramentas moleculares requer rigor, sobretudo no design e verificação das sequências, manutenção da grelha de leitura, e controlo dos pontos de inserção para garantir o sucesso da expressão e funcionalidade dos constructos.
A utilização conjunta de clonagem tradicional e ferramentas digitais permite projetar e testar múltiplas variantes em tempo razoável e com custos reduzidos.
A abordagem aprendida é essencial para estudar a função biológica das proteínas, impacto das PTMs e interações em contexto celular.

Acquisição de imagens no Microscopio

6 Março 2025, 09:00 • Federico Herrera Garcia

Aquisição de imagens no microscópio de fluorescência a 40X, em grupos de 4-5 estudantes.
Nesta sessão, foram novamente explicados os princípios da fluorescência e as características dos corantes utilizados. Cada grupo fotografou os seus próprios grupos experimentais, tendo sido obtidas imagens em número suficiente para quantificar a translocação de STAT3 para o núcleo na presença de LIF.

Microscopia de fluorescência

28 Fevereiro 2025, 14:00 • Federico Herrera Garcia

No segmento de microscopia, o objetivo era visualizar a localização de proteínas de interesse (e.g., STAT3 e mutantes) em células HeLa, recorrendo a marcação fluorescente.

Preparação das amostras:
Mais uma vez, existiam grupos de células não tratadas e tratadas com LIF (100 ng/mL). Após o tratamento, o meio foi decantado e as células foram lavadas duas vezes com PBS.
Fixação:
Adicionou-se metanol frio (-20°C) às células para fixação, mantendo as placas no congelador durante 10 minutos.
Lavagens e coloração nuclear (opcional):
Após remover totalmente o metanol, as células foram lavadas com PBS. Se desejado, realizou-se coloração dos núcleos com DAPI, incubando 5 minutos no escuro e lavando novamente com PBS.
Preparação final:
Após a última lavagem, as amostras estavam prontas para observação no microscópio de fluorescência, sendo organizadas as sessões de aquisição por grupos e horários previamente estipulados.