Sumários
Desenho Experimental e Ferramentas Moleculares (DEFM) I: Escolha de reagentes adequados e estudo dirigido das vias de NFkB e STAT3
14 Março 2024, 09:00 • Federico Herrera Garcia
Nesta sessão, os estudantes fizeram pesquisa sobre as vias de NFkB e STAT3 e a sua ativação por TNFalfa em aula, com o fim de obter informação relevante para ser utilizada na introdução e na discussão dos artigos. A informação encontrada foi discutida pela sua possível relevância para o trabalho a desenvolver. Também se investigou nas células HeLa e se fez um exercício para justificar o seu uso em comparação com outras possíveis linhas celulares. Depois de lembrar mais uma vez o desenho experimental e as técnicas que iriamos seguir, se procedeu a procurar anticorpos primários e secundários adequados para realizar as experiências de western blotting e imunocitoquímica; diferentes versões de TNFalfa; médios de cultivo adequados para as células HeLa; e outros reagentes relevantes para esta experiência. Estes reagentes deveriam ser a base para a construção dos métodos do artigo.
SIM Sessão 1
14 Março 2024, 09:00 • João André Isidoro Miranda
| Simulação do comportamento da via de NF-κB em resposta a TNF-ɑ (parte 1) |
DEFM III: Desenho de ferramentas CRISPR/Cas9, confirmação por western blotting, PCR e sequenciação
8 Março 2024, 14:00 • Federico Herrera Garcia
Nesta última sessão do módulo de desenho experimental e de ferramentas moleculares, fiz uma apresentação de 20 min sobre origem e fundamentos dos sistemas CRISPR/Cas9; e as diferenças entre os sistemas naturais de CRISPR e os que utilizamos para manipular genomas. Trabalhou-se a nomenclatura destes sistemas, e se mostraram duas ferramentas online que permitiam o desenho de RNAs guia a partir de sequências genómicas de interesse, nomeadamente Benchling e Vectorbuilder. Desenharam um vetor a expressar um RNA guia contra uma sequência de STAT3, a nuclease Cas9 e um marcador fluorescente para poder selecionar as células que incorporaram o sistema CRISPR por FACS. Depois desenharam primers para amplificar o local alvo do sistema CRISPR no genoma humano por PCR, e para sequenciar estes produtos de PCR. Analisaram cromatogramas de sequenciação e se mostrou como se podiam representar estas ferramentas/métodos/resultados num artigo.
DEFM III: Desenho de ferramentas CRISPR/Cas9, confirmação por western blotting, PCR e sequenciação
8 Março 2024, 09:00 • Federico Herrera Garcia
Nesta última sessão do módulo de desenho experimental e de ferramentas moleculares, fiz uma apresentação de 20 min sobre origem e fundamentos dos sistemas CRISPR/Cas9; e as diferenças entre os sistemas naturais de CRISPR e os que utilizamos para manipular genomas. Trabalhou-se a nomenclatura destes sistemas, e se mostraram duas ferramentas online que permitiam o desenho de RNAs guia a partir de sequências genómicas de interesse, nomeadamente Benchling e Vectorbuilder. Desenharam um vetor a expressar um RNA guia contra uma sequência de STAT3, a nuclease Cas9 e um marcador fluorescente para poder selecionar as células que incorporaram o sistema CRISPR por FACS. Depois desenharam primers para amplificar o local alvo do sistema CRISPR no genoma humano por PCR, e para sequenciar estes produtos de PCR. Analisaram cromatogramas de sequenciação e se mostrou como se podiam representar estas ferramentas/métodos/resultados num artigo.
DEFM II: Trabalho com sequências de DNA, desenho de siRNAs, desenho de plasmídeos para expressão de shRNAs
7 Março 2024, 14:00 • Federico Herrera Garcia
Nesta sessão, os estudantes se familiarizaram com ferramentas informáticas para trabalhar com sequências de DNA. Utilizamos o programa de livre acesso A Plasmid Editor e uma série de programas online para o desenho de siRNAs, shRNAs e vectores a expressar shRNAs, e para a procura de sequências genómicas. Explicaram-se os diferentes elementos de um plasmídeo, a utilização de enzimas de restrição, a tradução de sequências de DNA a aminoácidos, o desenho de oligonucleótidos para PCR e/ou sequenciação. Pesquisamos possíveis estratégias para inibir STAT3, incluindo também procura de inibidores farmacológicos, de cada um dos quais se explicaram os detalhes das especificações. Esta aula serve para preparar os estudantes para o desenho de ferramentas CRISPR na seguinte (e última) sessão deste módulo.