Introdução ao tema das PLs e preparação dos vectores de clonagem e do fragmento de DNA a clonar

6 Março 2017, 12:30 • Rita Zilhão

1.       Clonagem da região reguladora de um gene num vector de expressão

Objectivos da clonagem molecular

Preparação dos vectores de clonagem e do fragmento de DNA a clonar

Digestão dos vectores pNM480/481/482 com as enzimas de restrição EcoRI/PstI.

Electroforese em gel analítico Electroforese em gel preparativo e purificação dos fragmentos EcoRI/PstI de 740 pb, a clonar nos vectores pNM480/481/482.

Electroforese em gel preparativo do plasmídio recombinante pRZA18 digerido com EcoRI/PstI e purificação do fragmento de 740 pb, a clonar dos vectores pNM480/481/482.

Visualização em gel de agarose dos produtos de digestão dos vectores e do fragmento purificado, e avaliação das quantidades relativas de DNA (vectores e fragmento) a utilizar na clonagem.

CONCEITOS: purificação e armazenamento do DNA

Introdução ao tema das PLs e preparação dos vectores de clonagem e do fragmento de DNA a clonar

3 Março 2017, 10:30 • Rita Zilhão

1.       Clonagem da região reguladora de um gene num vector de expressão

Objectivos da clonagem molecular

Preparação dos vectores de clonagem e do fragmento de DNA a clonar

Digestão dos vectores pNM480/481/482 com as enzimas de restrição EcoRI/PstI.

Electroforese em gel analítico Electroforese em gel preparativo e purificação dos fragmentos EcoRI/PstI de 740 pb, a clonar nos vectores pNM480/481/482.

Electroforese em gel preparativo do plasmídio recombinante pRZA18 digerido com EcoRI/PstI e purificação do fragmento de 740 pb, a clonar dos vectores pNM480/481/482.

Visualização em gel de agarose dos produtos de digestão dos vectores e do fragmento purificado, e avaliação das quantidades relativas de DNA (vectores e fragmento) a utilizar na clonagem.

CONCEITOS: purificação e armazenamento do DNA

3. Metodologia da manipulação génica e clonagem molecular geral

3 Março 2017, 08:00 • Rita Zilhão

3. Metodologia da manipulação génica e clonagem molecular geral

Clonagem molecular: significado, objectivos e etapas. O papel dos ácidos nucleicos na clonagem molecular. Tipo de hospedeiros: hospedeiros procarióticos e principais hospedeiros eucarióticos (células animais e vegetais, linhas celulares, culturas primárias e tecidos).

Construção de moléculas de DNA recombinante. Preparação de DNA vector e DNA dador. Métodos de produção de fragmentos de DNA e de modificação de extremidades (DNA polimerases, fosfatases de DNA, transferase terminal; adição de linkers e adaptadores). Estratégias de ligação de DNA vector e DNA dador (ligases de DNA). Clonagem dirigida e clonagem não dirigida. 

As PLs só tiveram início a 3 de Março

24 Fevereiro 2017, 10:30 • Rita Zilhão

As PLs só tiveram início a 3 de Março.

2. Manipulação dos ácidos nucleicos: enzimologia, isolamento, quantificação e marcação

24 Fevereiro 2017, 08:00 • Rita Zilhão

2. Manipulação dos ácidos nucleicos: enzimologia, isolamento, quantificação e marcação

Breve resumo histórico do desenvolvimento da clonagem molecular. Noção de clonagem molecular e de clone molecular. Enzimologia do DNA recombinante. Enzimas de restrição. Enzimas de restrição de tipo II. Mapa de restrição. Importância dos sistemas de restrição/modificação em clonagem molecular.

Isoesquizómeros. Enzimas de modificação: nucleases, polimerases, fosfatases e cinases. DNA ligases. Propriedades físicas e químicas dos ácidos nucleicos e os seus métodos de visualização e quantificação. Fundamento de alguns processos de isolamento e purificação dos ácidos nucleicos. Métodos de quantificação dos ácidos nucleicos baseados na espectrofotometria e em matrizes (agarose e poliacrilamida) sujeitas a electroforese.