Genética forense e genética clínica

7 Dezembro 2021, 15:30 • Patricia Beldade

Utilização de marcadores genéticos em investigação forense e na prática clínica. A Genética Forense envolve identificar indivíduos ou linhagem a que pertencem através do seu perfil genético. A Genética Clínica envolve a utilização de marcadores genéticos para diagnóstico, etiologia, prognóstico e decisões sobre o tratamento de doenças humanas. 

1) STRs (microssatélites). Utilização de STRs em investigação forense. Propriedades relevantes dos STRs nestas aplicações, incluindo robustez, capacidade de descriminação, facilidade de análise, possibilidade de multiplex. Kits de marcadores e bases de dados de perfis partilhados internacionalmente. Exemplos de utilização de STRs em diferentes tipos de investigação forense: criminalística biológica, identificação de identidade genética individual, investigação biológica de parentesco. Utilização de STRs na genética clínica menos comum mas existem doenças associadas à expansão de STRs. 

2) SNPs. Utilização de SNPs em investigação forense. Propriedades relevantes dos SNPs nestas aplicações, incluindo serem pequenos (e, portanto, passíveis de ser usados em DNA mais degradado), abundantes e presentes em diferentes zonas do genoma. Exemplos de utilização de SNPs em diferentes tipos de investigação forense: identificação de indivíduos, identificação de características fenotípicas (EVCs: externally visible characters), estudos de linhagens e relações familiares e estudos de ancestralidade. Utilização de SNPs em investigação clínica. Distinção entre SNPs e SNVs. Exemplos de marcadores associados a doenças: BRAC1 em oncogenética, CYP em farmacogenética, marcadores associados a diabetes. Uso de técnicas de NGS para genotipagem de alto débito e para sequenciação de genomas inteiros cada vez mais a ser usados na genética clínica.

Aula lecionada pelo convidado, Doutor Paulo Dário, especialista em genética forense e genética médica e com trabalho em ambas as áreas enquanto investigador no Instituto de Medicina Legal e, mais recentemente, no Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge.

Revisões e preparação do trabalho de projecto

6 Dezembro 2021, 08:30 • Patricia Beldade

Revisões da matéria dada. Diferentes tipos de marcadores e aplicações. Propriedades de marcadores, incluindo dominância e neutralidade de marcadores individuais e desequilíbrio de “linkage” entre marcadores. Técnicas utilizadas no desenvolvimento ou aplicação de marcadores. Marcadores para aferir identidade ou propriedades de indivíduos, relações de parentesco, estrutura de populações, relações entre espécies e composição de comunidades de organismos. Uso de marcadores para identificar selecção e a base genética de variação fenotípica e adaptação. Aplicação de marcadores em diferentes domínios, incluindo a biologia evolutiva e ecologia, a biomedicina e a investigação forense. Organização do material de estudo, incluindo sumários na plataforma Fenix e PDFs no Moodle. Plano para a apresentação dos projectos dos estudantes: objectivos, estrutura, organização dos grupos, organização das sessões, esclarecimento de dúvidas.

Detecção e sequenciação de SARS-Cov-2

2 Dezembro 2021, 12:00 • Patricia Beldade

Seguimento do SARS-CoV-2 continuado, com alterações de protocolos e acumulação de dados em pouco tempo. 

1) Testes de diagnóstico de SARS-CoV-2 usando “quantititive real-time PCR” (qPCR). Material biológico isolado de pessoas (maioritariamente com zaragatoa intra-nasal mas também saliva) em que o vírus é neutralizado quimicamente antes de o RNA ser extraído (de forma automotizada e robotizada) nos laboratórios de diagnóstico. Protocolo em “one step”, com passagem de RNA a cDNA (com a enzima Reverse Transcriptase) seguida da amplificação do DNA (por qPCR), num mesmo tubo. Usam-se “primers” de PCR para material viral (e para gene humano como controlo) e detecta-se amplicões através da fluorescência emitida por “region-specific probes” (no caso dos laboratórios de diagnóstico certificados na Europe, usam-se 3 “probes” contra diferentes genes virais). Critérios de detecção baseados em valores de CT para as diferentes “probes”. Caso de “drop-out” em que uma das “probes” não funciona podem reflectir uma variante do vírus (e.g. “drop-out” nas variantes Delta e Omicron). 

2) Seguimento da origem e grupos de transmissão do SARS-CoV-2 usando técnicas de NGS (Nanopore e Illumina) e uma estratégia de amplificação do genoma viral via duas PCR multiplex cada uma com 48 pares de “primers” intercalados. Obtenção do primeiro genoma viral com recursos a RNA-seq e uma estratégia que enriquecia o RNA viral em detrimento do RNA do hospedeiro. Duas estratégias para lidar (bioinformaticamente) com as “reads” resultantes de sequenciação de novas amostras: “mapping” (contra o genoma de referência) ou “assembly” (“de novo”). Organização do genoma viral, taxa de mutação e identificação de “clusters”, incluindo estudos em Portugal que continuam a ser feitos. O que define uma nova variante: conjunto de mutações com particular enfoque no gene que codifica a proteína Spike do vírus. Nomenclatura das variantes. Interacção entre a Spike viral o o receptor humano Ace2. Plataformas públicas de armazenamento e visualização dos dados de sequência do genoma viral. Algumas variantes a ser seguidas incluindo Delta e Omicron; interesse na transmissibilidade e na virulência. Exemplos de eventos de “super-spreaders” (e.g.  festa da Latada em Coimbra) e de re-introduções recorrentes (e.g. “golfers” do Reino Unido no Algarve) em Portugal.

Aula lecionada em zoom pelo convidado, especialista em DNA sequencing & analysis, Doutor Ricardo Leite, coordenador da Unidade de Genómica do Instituto Gulbenkian de Ciência.

Genética da conservação de cetáceos

30 Novembro 2021, 15:30 • Patricia Beldade

Desafios particulares de estudos de cetáceos. Ameaças a populações naturais de cetáceos. O caso da toninha vaquita (nome latim Phocoena sinus) de que só há registo de 10 indivíduos no planeta e que se prevê seja a próxima espécie de mamífero a extinguir-se. Técnicas para seguir e para amostrar cetáceos que permitem o estudo destas espécies (genómica e química) bem como dos microorganismos que lhes estão associados. Tipos de aplicações de marcadores genéticos nos estudos de cetáceos, incluindo determinação do sexo e genética de populações. Tipos de marcadores usados: mtDNA, microssatélites, SNPs.

Exemplo 1: Estudo das populações da baleia corcunda do Hemisfério Sul. Necessidade de actualizar a informação da estrutura populacional destas baleias para que a Comissão Baleeira Internacional possa regular. Amostragem em diferentes locais de procriação (mais próximos do Equador) e locais de alimentação (mais para Sul). Combinação de estudos de diferentes equipas responsáveis por “seguir” as baleias de diferentes zonas geográficas, presumivelmente correspondendo a diferentes rotas de migração. Possibilidade de “mistura” entre rotas, com indivíduos que se deslocam entre elas e “diluem” a diferenciação entre elas. Estudo usando amostras biológicas colhidas primariamente de indivíduos vivos (juvenis e adultos) em diferentes locais e diferentes alturas. Uso de marcadores microssatélite (10 pares de “primers” usados em reações multiplex cada uma com 3-4 pares) e mtDNA. Uso para determinar o sexo dos indivíduos amostrados, bem como a diversidade genética e a estrutura populacional com cálculo da heterozigotia esperada e observada, Fst e “genetic clusters” (via análise no programa Structure). Resultados publicados no artigo Kershaw et al. Molecular Ecology (2017).

Exemplo 2: Estudo dos golfinhos roazes do Atlântico Norte. Distinção entre populações mediterrânicas, pelágicas e costeiras. Estudo da estrutura populacional dos roazes do Atlântico Norte usando como amostras, biópsias de animais vivos e arrojamentos, e como marcadores, 22 loci microssatélite. Procura de relação entre a estrutura populacional e o habitat específico (incluindo adaptação local) e com a estrutura social das populações. Enfoque nas populações costeiras, que incluem algumas populações residentes, como a do estuário do Sado. Redução das populações costeiras e ameaças que sofrem, incluindo os contaminantes químicos PCBs. Relevância do estudo no contexto de esforços de conservação e directivas europeias que definem áreas específicas de proteção chamadas SACs (special areas of conservation). Enfoque na população residente dos golfinhos do Sado a ser seguidos no tempo. Compilação de estudos europeus com análise genétics de mtDNA e microssatélites que permitiu calcular heterozigotia observada (Ho) e esperada (He), allelic richness, e relações de parentesco entre golfinhos amostrados. Dados usados para estimar Fst, número de clusters genéticos. Identificação da população do Sado como uma população distinta das restantes e com baixos níveis de variabilidade genética. Estudo ainda em curso que irá também incluir SNPs para uma análise de estrutura populacional mais fina e para procurar regiões do genoma sob seleção.

Aula lecionada pela convidada, especialista em genética da conservação de cetáceos, Doutora Inês Carvalho, investigadora de pós-Doutoramento no grupo da Conservation Genetics do Instituto Gulbenkian de Ciência.

Associação entre marcadores

29 Novembro 2021, 08:30 • Patricia Beldade

Linkage genético e desequílibrio de linkage: definições, propriedades, medidas e aplicações. Distância genética e frequência de recombinação. Construção de mapas genéticos. Relação entre frequências haplotípicas e frequências alélicas numa população. Exercício.

(Por ser feriado na quarta, dia da TP12, a aula de segunda foi dada em zoom e gravada para disponibilizar para os alunos de quarta)