Sumários
TP 11 : Revisões e preparação do trabalho de projecto
7 Dezembro 2023, 10:00 • Patricia Beldade
Revisões da matéria dada. Diferentes tipos de marcadores e aplicações. Propriedades de marcadores, incluindo dominância e neutralidade de marcadores individuais e desequilíbrio de “linkage” entre marcadores. Técnicas utilizadas no desenvolvimento ou aplicação de marcadores. Marcadores para aferir identidade ou propriedades de indivíduos, relações de parentesco, estrutura de populações, relações entre espécies e composição de comunidades de organismos. Uso de marcadores para identificar selecção e a base genética de variação fenotípica e adaptação. Aplicação de marcadores em diferentes domínios, incluindo a biologia evolutiva e ecologia, a biomedicina e a investigação forense. Organização do material de estudo, incluindo sumários na plataforma Fenix e PDFs no Moodle. Plano para a apresentação dos projectos dos estudantes: objectivos, estrutura, organização dos grupos, organização das sessões, esclarecimento de dúvidas.
T 21: Genética forense e genética clínica [Dr. Paulo Dário]
5 Dezembro 2023, 15:30 • Patricia Beldade
Utilização de marcadores genéticos em investigação forense e na prática clínica.
A Genética Forense envolve identificar indivíduos através do seu perfil genético. Pode ser usada para identificação individual (e.g. saber se restos mortais correspondem a pessoas dadas como desaparecidas), determinação de parentesco (e.g. estabelecimento de paternidade), criminalística biológica (e.g. colocar suspeito no local e altura dum crime – análise que é tipicamente probabilística), estudos de acidentes em massa (em que há muitos restos mortais) e em questões de imigração (e.g. estabelecimento de se candidatos a imigrar são, de facto, descendentes directos de residentes).
A Genética Clínica envolve a utilização de marcadores genéticos para diagnóstico (e.g. “teste do pezinho” que faz parte do Plano Nacional de Rastreio Neonatal que rastreia cerca de 40 doenças de base genética conhecida), etiologia (e.g. diabetes), prognóstico e terapêutica (e.g. decisões sobre o tratamento) de doenças humanas.
Usam-se sobretudo STRs (microssatélites) e SNPs.
1) Utilização de STRs em investigação forense. Propriedades relevantes dos STRs nestas aplicações, incluindo robustez, capacidade de descriminação, facilidade de análise, possibilidade de multiplex. Kits de marcadores e bases de dados de perfis partilhados internacionalmente. (e.g. CODIS) Exemplos de utilização de STRs em diferentes tipos de investigação forense: criminalística biológica, identificação de identidade genética individual, investigação biológica de parentesco. A utilização de STRs na genética clínica é menos comum mas existem doenças (geralmente neurodegenerativas) associadas à expansão de STRs.
2) Utilização de SNPs em investigação forense. Propriedades relevantes dos SNPs nestas aplicações, incluindo serem pequenos (e, portanto, passíveis de ser usados em DNA mais degradado), abundantes e presentes em diferentes zonas do genoma, baixa taxa de mutação. Exemplos de utilização de SNPs em diferentes tipos de investigação forense: identificação de indivíduos, identificação de características fenotípicas (EVCs: externally visible characters), estudos de linhagens e relações familiares e estudos de ancestralidade. Utilização de SNPs em investigação clínica. Distinção entre SNPs (single nucleotide polimorphism) vs e SNVs (single nucletodide variant, em que os minor alleles são de frequência tão baixa que eles são usados como marcadores individuais ou familiares e não populacionais, como os SNPs). Exemplos de marcadores associados a doenças: BRAC1 em oncogenética, CYP em farmacogenética, marcadores associados a diabetes. Efeitos variáveis de alelos de marcadores usados em genética clinica: de patogénico a benigno. Uso de técnicas de NGS para genotipagem de alto débito e para sequenciação de genomas inteiros cada vez mais a ser usados na genética clínica.
TP 10: Associação entre marcadores
4 Dezembro 2023, 14:00 • Patricia Beldade
Linkage genético e desequílibrio de linkage: definições, propriedades, medidas e aplicações. Distância genética e frequência de recombinação. Construção de mapas genéticos. Relação entre frequências haplotípicas e frequências alélicas numa população. Exercícios. Continuação do trabalho de grupo.
T 20: Uso de NGS no seguimento de infecções e epidemias
30 Novembro 2023, 12:30 • Patricia Beldade
Exibição e explicação do MiniOn, sequenciador Nanopore portátil que produz até 50 Gb de sequências que podem ir sendo seguidas directamente num computador. Este tipo de aparelho está a ser usado em vários projectos NGS do IGC. Exemplo 1: Xylella fastidiosa: bactérias patogénica em plantas. Sequenciação do genoma para detecção de espécies – revelou-se mais rápido que o teste diagnóstico com PCR. Exemplo 2: Resistência de plasmódio a fármacos anti-malária. Exemplo de “real-time adaptitive sampling” em que poros cuja sequência é identificada como humana são parados, enriquecendo-se para sequência do plasmódio, cujo genoma é significativamente menor do que o humano. Sem a técnica de enriquecimento, obter-se-iam muitas mais reads de humano do que de plasmódio. Ao contrário da tecnologia Illumina que gera short-reads e tem uma taxa de erro de cerca de 0.1% (i.e. 1 erro em cada 1000 bp), a tecnologia Nanopore gera long-reads e tem uma taxa de erro que hoje em dia já está perto dos 2% (i.e. 2 erros em cada 100 bp). Apesar da taxa de erro relativamente elevada, a sequência gerada é o consenso dum elevadíssimo número de reads e isso permite descartar grande parte dos erros. Exemplo 3: uso de Nanopore para “amplicon sequencing”.
Detecção e seguimento de infecções por SARS-CoV-2, virus de RNA com um genoma de cerca de 30 mil bases (30 Kb).
1) Testes de diagnóstico de SARS-CoV-2 usando “quantititive real-time PCR” (qPCR). Material biológico isolado de pessoas (maioritariamente com zaragatoa intra-nasal mas também saliva) em que o vírus é neutralizado quimicamente antes de o RNA ser extraído (de forma automotizada e robotizada) nos laboratórios de diagnóstico. Protocolo em “one step”, com passagem de RNA a cDNA (com a enzima Reverse Transcriptase) seguida da amplificação do DNA (por qPCR), num mesmo tubo. Usam-se “primers” de PCR para material viral (e para gene humano como controlo) e detecta-se amplicões através da fluorescência emitida por “region-specific probes” (no caso dos laboratórios de diagnóstico certificados na Europe, usam-se 3 “probes” contra diferentes genes virais). Critérios de detecção baseados em valores de CT para as diferentes “probes”. Caso de “drop-out” em que uma das “probes” não funciona podem reflectir uma variante do vírus (e.g. “drop-out” nas variantes Delta e Omicron).
2) Seguimento da origem e grupos de transmissão do SARS-CoV-2 usando técnicas de NGS (Nanopore e Illumina) e uma estratégia de amplificação do genoma viral via duas PCR multiplex cada uma com 49 pares de “primers” intercalados. Obtenção do primeiro genoma viral com recursos a RNA-seq e uma estratégia que enriquecia o RNA viral em detrimento do RNA do hospedeiro. Houve muita optimização de protocolos e consegue-se agora ir de zaragatoa a genoma viral em 6hr. Duas estratégias para lidar (bioinformaticamente) com as “reads” resultantes de sequenciação de novas amostras: “mapping” (contra o genoma de referência) ou “assembly” (“de novo”). Organização do genoma viral, taxa de mutação e identificação de “clusters”, incluindo estudos em Portugal. O que define uma nova variante: conjunto de mutações com particular enfoque no gene que codifica a proteína Spike do vírus. Nomenclatura das variantes. Interacção entre a Spike viral o o receptor humano Ace2. Plataformas públicas de armazenamento e visualização dos dados de sequência do genoma viral. Ainda que o esforço tenha abrandado, continua a fazer-se sequenciação de SARS-CoV-2 para detecção de novas variantes e vigilância de novas mutações. Interessa também saber se as variantes virais diferem na interacção com o hospedeiro. Lidar com a enorme quantidade de dados gerados permanece um desafio. computacional
Aula lecionada em zoom pelo convidado, especialista em DNA sequencing & analysis, Doutor Ricardo Leite, coordenador da Unidade de Genómica do Instituto Gulbenkian de Ciência.
TP 10: Associação entre marcadores
30 Novembro 2023, 10:00 • Patricia Beldade
Linkage genético e desequílibrio de linkage: definições, propriedades, medidas e aplicações. Distância genética e frequência de recombinação. Construção de mapas genéticos. Relação entre frequências haplotípicas e frequências alélicas numa população. Exercícios. Continuação do trabalho de grupo.