Sumários
Aula 14. Regulação Metabólica Clássica: o passo limitante (Cont.)
14 Abril 2026, 14:00 • Federico Herrera Garcia
Exemplo: glicólise
A glicólise é utilizada como exemplo para ilustrar estes conceitos.
Embora várias etapas sejam termodinamicamente irreversíveis (hexocinase, fosfofrutocinase e piruvato cinase), a reação geradora de fluxo depende do contexto metabólico e das condições fisiológicas, não podendo ser identificada apenas com base na termodinâmica.
Métodos para identificar passos regulatórios
São apresentados vários métodos experimentais para identificar os pontos de controlo das vias metabólicas, incluindo:
- Comparação entre reações em equilíbrio e não equilíbrio.
- Medição das concentrações de metabolitos.
- Análise das velocidades enzimáticas.
- Teorema do crossover.
- Titulação com inibidores.
Estas abordagens permitem localizar as reações responsáveis pelo controlo do fluxo metabólico.
Regulação metabólica
A regulação pode ser:
- Interna, transmitindo as alterações de fluxo ao longo da via sem modificar diretamente o seu controlo.
- Externa, atuando sobre as reações geradoras de fluxo através de efetores alostéricos, hormonas ou alterações na disponibilidade de co-substratos.
Limitações da visão clássica
A aula termina referindo que o conceito de um único passo limitante foi posteriormente expandido pela Análise de Controlo Metabólico (Metabolic Control Analysis, MCA), segundo a qual o controlo do fluxo pode estar distribuído por várias enzimas de uma mesma via, embora as reações geradoras de fluxo continuem a desempenhar um papel central na regulação metabólica.
Aula 13. Regulação Metabólica Clássica: o passo limitante
13 Abril 2026, 12:00 • Federico Herrera Garcia
Esta aula apresenta a abordagem clássica da regulação metabólica, centrada na identificação do passo limitante de uma via metabólica e das enzimas responsáveis pelo controlo do fluxo. São discutidos os conceitos de reações em equilíbrio e não equilíbrio, bem como os critérios experimentais utilizados para identificar os principais pontos de regulação.
Metabolismo e vias metabólicas
O metabolismo corresponde ao conjunto das reações químicas que permitem a manutenção da vida. Numa via metabólica, o fluxo é determinado pelas reações que se encontram afastadas do equilíbrio e que funcionam como pontos de controlo da atividade da via.
Reações em equilíbrio e não equilíbrio
As reações próximas do equilíbrio apresentam elevada atividade enzimática, respondem rapidamente a alterações nas concentrações de substratos e produtos e permitem a reversibilidade das vias metabólicas.
Em contraste, as reações longe do equilíbrio apresentam maior direcionalidade, são frequentemente reguladas por mecanismos alostéricos ou hormonais e constituem os principais locais de controlo do fluxo metabólico.
O passo limitante
Segundo a visão clássica, o passo limitante corresponde a uma reação em não equilíbrio que controla o fluxo da via. Esta reação não é necessariamente a mais lenta, mas sim aquela que determina a velocidade global e responde aos principais mecanismos regulatórios.
A identificação deste passo permite compreender como as células ajustam o metabolismo às necessidades fisiológicas.
Avaliação TPs: Produção de um sistema de expressão em mamíferos para visualizar interações proteína-proteina
1 Abril 2026, 12:30 • Federico Herrera Garcia
Neste exercício final, os estudantes fizeram essencialmente o mesmo que que nas TPs anteriores da Sinalização Celular mas a tempo real (1 hora), com proteínas diferentes (para testar a sua habilidade para encontrar sequências online), monitorizados pelo professor, e seguindo instruções básicas. Havia dois possíveis exercícios:
Exercício A:
1. OBJETIVO: Fazer um plasmídeo bicistrónico para analisar a possível interação entre as proteínas Vimentina (VIM) e TOMM6, i.e. entre o citoesqueleto de filamentos intermédios e as mitocôndrias.
2. A clonagem será feita a partir de produtos de PCR obtidos de sequências encontradas em outros plasmídeos do nosso lab, e utilizando enzimas de restrição.
3. Para observar a interação, iremos fusionar cada uma das proteínas de interesse com dois fragmentos complementares da proteína fluorescente mNeonGreen, um desde os aminoácidos 1-210 e outro do resíduo 211 até o fim da proteína fluorescente.
4. Os dois genes de fusão devem estar separados pela sequência P2A, disponível no Moodle. A sequência P2A pode ter sido incluída num dos primers de PCR durante a amplificação de algum dos insertos.
5. O vetor onde iremos clonar os genes quiméricos é o pcDNA 3.1+. Está disponível no Moodle, nos materiais das TPs.
6. TOMM6 é uma proteína pequena inserida na membrana externa das mitocôndrias, com o N-terminus na parte citosólica. Um dos fragmentos da proteína fluorescente deve estar ligado a este extremo.
7. A VIM pode levar uma tag nos extremos N- ou C-terminais.
8. Finalmente, queremos testar o efeito da defosforilação do resíduo na Y61 da VIM na interacção com TOMM6. Indica os primers de mutagénesis que utilizarias na própria sequência do constructo.
Exercício B:
1. OBJETIVO: Fazer um plasmídeo bicistrónico para analisar a possível relação funcional entre as proteínas Neuronatin (NNAT) e Cortexin-2 (CTXN2), duas proteínas de função desconhecida.
2. A clonagem será feita a partir de produtos de PCR obtidos de sequências encontradas em outros plasmídeos do nosso lab, inseridos num vetor vazio pLVX utilizando enzimas de restrição. O vetor pLVX está disponível no Moodle, nos materiais das TPs.
3. Para observar a interação, iremos fusionar cada uma das proteínas de interesse com duas proteínas fluorescentes que façam FRET. Não podem ser mCherry e/ou as escolhidas nos exercícios entregues no Moodle.
4. Os dois genes de fusão devem estar separados pela sequência P2A, disponível no Moodle. A sequência P2A pode ter sido incluída num dos primers de PCR durante a amplificação de algum dos insertos.
5. CTXN2 é uma proteína pequena inserida na membrana celular, com o N-terminus na parte extracelular. A NNAT é uma proteína citosólica, solúvel.
6. As tags fluorescentes devem estar localizadas nas sequências proteicas de forma a permitir FRET se NNAT e CTXN2 interagem.
7. Finalmente, queremos testar o efeito da fosforilação do resíduo S56 da NNAT na interação das duas proteínas. Indica o primer de mutagénesis que utilizarias na própria sequência do constructo.
Avaliação TPs: Produção de um sistema de expressão em mamíferos para visualizar interações proteína-proteina
31 Março 2026, 15:30 • Federico Herrera Garcia
Neste exercício final, os estudantes fizeram essencialmente o mesmo que que nas TPs anteriores da Sinalização Celular mas a tempo real (1 hora), com proteínas diferentes (para testar a sua habilidade para encontrar sequências online), monitorizados pelo professor, e seguindo instruções básicas. Havia dois possíveis exercícios:
Exercício A:
1. OBJETIVO: Fazer um plasmídeo bicistrónico para analisar a possível interação entre as proteínas Vimentina (VIM) e TOMM6, i.e. entre o citoesqueleto de filamentos intermédios e as mitocôndrias.
2. A clonagem será feita a partir de produtos de PCR obtidos de sequências encontradas em outros plasmídeos do nosso lab, e utilizando enzimas de restrição.
3. Para observar a interação, iremos fusionar cada uma das proteínas de interesse com dois fragmentos complementares da proteína fluorescente mNeonGreen, um desde os aminoácidos 1-210 e outro do resíduo 211 até o fim da proteína fluorescente.
4. Os dois genes de fusão devem estar separados pela sequência P2A, disponível no Moodle. A sequência P2A pode ter sido incluída num dos primers de PCR durante a amplificação de algum dos insertos.
5. O vetor onde iremos clonar os genes quiméricos é o pcDNA 3.1+. Está disponível no Moodle, nos materiais das TPs.
6. TOMM6 é uma proteína pequena inserida na membrana externa das mitocôndrias, com o N-terminus na parte citosólica. Um dos fragmentos da proteína fluorescente deve estar ligado a este extremo.
7. A VIM pode levar uma tag nos extremos N- ou C-terminais.
8. Finalmente, queremos testar o efeito da defosforilação do resíduo na Y61 da VIM na interacção com TOMM6. Indica os primers de mutagénesis que utilizarias na própria sequência do constructo.
Exercício B:
1. OBJETIVO: Fazer um plasmídeo bicistrónico para analisar a possível relação funcional entre as proteínas Neuronatin (NNAT) e Cortexin-2 (CTXN2), duas proteínas de função desconhecida.
2. A clonagem será feita a partir de produtos de PCR obtidos de sequências encontradas em outros plasmídeos do nosso lab, inseridos num vetor vazio pLVX utilizando enzimas de restrição. O vetor pLVX está disponível no Moodle, nos materiais das TPs.
3. Para observar a interação, iremos fusionar cada uma das proteínas de interesse com duas proteínas fluorescentes que façam FRET. Não podem ser mCherry e/ou as escolhidas nos exercícios entregues no Moodle.
4. Os dois genes de fusão devem estar separados pela sequência P2A, disponível no Moodle. A sequência P2A pode ter sido incluída num dos primers de PCR durante a amplificação de algum dos insertos.
5. CTXN2 é uma proteína pequena inserida na membrana celular, com o N-terminus na parte extracelular. A NNAT é uma proteína citosólica, solúvel.
6. As tags fluorescentes devem estar localizadas nas sequências proteicas de forma a permitir FRET se NNAT e CTXN2 interagem.
7. Finalmente, queremos testar o efeito da fosforilação do resíduo S56 da NNAT na interação das duas proteínas. Indica o primer de mutagénesis que utilizarias na própria sequência do constructo.
Aula 12. Barreira cinética II: Regulação da quantidade de enzima (Continuação)
31 Março 2026, 14:00 • Federico Herrera Garcia
Enzimas limitantes da velocidade
Algumas vias metabólicas possuem uma enzima limitante da velocidade (rate-limiting enzyme), responsável pelo principal ponto de controlo do fluxo metabólico.
São apresentados como exemplos a tirosina hidroxilase, na síntese da dopamina, e a arilalquilamina N-acetiltransferase (AANAT), cuja expressão e atividade regulam a síntese de melatonina de acordo com o ritmo circadiano.
Reprogramação celular
A aula termina com a descoberta das células estaminais pluripotentes induzidas (iPS), demonstrando que células somáticas diferenciadas podem ser reprogramadas através da expressão de quatro fatores de transcrição (Oct3/4, Sox2, Klf4 e c-Myc), conhecidos como fatores de Yamanaka.
Esta descoberta revolucionou a biologia do desenvolvimento e abriu novas perspetivas para a medicina regenerativa e a terapia celular.
Conclusão
A regulação da quantidade de enzima permite adaptar o funcionamento das vias metabólicas através do controlo da expressão génica e da degradação proteica. A elevada complexidade destes mecanismos confere grande flexibilidade às células e explica como pequenas alterações regulatórias podem produzir efeitos biológicos significativos.