Sumários

Aula 11. Barreira cinética II: Regulação da quantidade de enzima

30 Março 2026, 12:00 • Federico Herrera Garcia

Esta aula aborda a regulação bioquímica através da alteração da quantidade de enzima disponível na célula. Ao contrário da regulação da atividade enzimática, este mecanismo envolve alterações na expressão génica e na degradação das proteínas, permitindo adaptar o metabolismo a médio e longo prazo.

Regulação da quantidade de enzima

A quantidade de uma enzima resulta do equilíbrio entre a sua biossíntese e degradação. As enzimas regulatórias apresentam, em geral, tempos de turnover mais curtos do que as proteínas estruturais, permitindo respostas rápidas às necessidades da célula.

Expressão génica

A síntese de proteínas depende de múltiplas etapas, incluindo transcrição, processamento do RNA, transporte do mRNA, tradução e processamento pós-traducional.

Nos eucariotas, a expressão génica é altamente regulada pela ação combinada de fatores de transcrição. A atividade destes fatores depende do contexto celular, podendo produzir respostas diferentes conforme o gene ou as restantes proteínas reguladoras presentes.

Sistemas biológicos não lineares

A regulação da expressão génica constitui um sistema altamente não linear, no qual pequenas alterações na atividade de fatores de transcrição ou na sequência do DNA podem originar grandes diferenças na expressão génica e no comportamento celular.

Este princípio está na base da variabilidade biológica e da medicina personalizada.

Construção de ferramentas moleculares para estudar processos de regulação bioquímica

25 Março 2026, 12:30 • Federico Herrera Garcia

Nesta TP, e em continuação de trabalhos prévios realizados nas aulas teóricas, os estudantes aprofundaram no trabalho com sequências de DNA, utilizando o programa de acesso livre A Plasmid Editor. Os estudantes exploraram o mapa e a sequência do plasmídeo de expressão em mamíferos pcDNA 3.1-. Identificaram os elementos mais relevantes de um plasmídeo e a sua função, incluído o local de clonagem múltipla. Aprenderam a marcar características na sequência, a identificar locais de enzimas de restrição, a representar o plasmídeo de diferentes formas, a traduzir sequências de DNA a aminoácidos, etc… Expliquei os procedimentos de clonagem com enzimas de restrição, e as chaves para criar quimeras ou proteínas de fusão com uma proteína de interesse e uma tag qualquer (neste caso fluorescente). Expliquei como encontrar sequências consenso dos nossos genes de interesse online (CCDS report, pubmed, uniprot), e também como encontrar as sequências e propriedades específicas de proteínas fluorescentes (FPbase). Os estudantes fizeram um constructo no qual meteram no local de clonagem múltipla (MCS) do vetor pcDNA3.1- uma proteína de interesse fusionada com mCherry.

Os estudantes aprenderam os procedimentos para realizar uma mutagénese dirigida num plasmídeo, por médio de PCR. Aprenderam a desenhar primers de mutagénese com um programam online (PrimerX), e desenharam primers para mutar diversos resíduos da proteína STAT3 que podiam ser modificados pós-traducionalmente. Aprendimos a fazer modificações que mimetizam fosforilação ou acetilação ou que bloqueiam estas modificações sem mudar demasiado a estrutura da proteína.

Finalmente, os estudantes avançaram mais na construção de plasmídeos de expressão mais complexos, para reafirmar conceitos como a utilização dos enzimas do local de clonagem múltipla, a necessidade de manter a grelha de leitura ao longo do todo o cistrão, a necessária ausência de codões STOP dentro dos constructos, etc… Combinamos este exercício com o desenho de um par FRET para analisar as interações entre proteínas. Os estudantes produziram um sistema bicistronico FRET, no qual fusionaram duas proteínas de interesse (STAT3 e STAT1) com duas proteínas fluorescentes que eram um par FRET. Entre as duas proteínas de fusão meteram uma sequência autoclivável P2A, o que permitiria expressar as duas proteínas de fusão a partir do mesmo promotor e do mesmo plasmídeo.

Os estudantes terminaram os trabalhos em casa, e entregaram-os no Moodle. Aqueles que entregaram a tempo (antes da avaliação final das TPs) também receberam feedback e avaliação.

Construção de ferramentas moleculares para estudar processos de regulação bioquímica

24 Março 2026, 15:30 • Federico Herrera Garcia

Os estudantes terminaram os trabalhos em casa, e entregaram-os no Moodle. Aqueles que entregaram a tempo (antes da avaliação final das TPs) também receberam feedback e avaliação.

Aula 10. Barreira cinética I: Regulação da velocidade de uma reação (Continuação)

24 Março 2026, 14:00 • Federico Herrera Garcia

Modelos de cooperatividade

São apresentados dois modelos clássicos que explicam a regulação alostérica:

Modelo de Monod-Wyman-Changeux (MWC), baseado na transição concertada entre estados conformacionais e particularmente adequado para explicar a cooperatividade positiva.
Modelo de Koshland-Némethy-Filmer (KNF), que propõe alterações conformacionais sequenciais induzidas pela ligação do ligando e permite explicar comportamentos mais complexos, incluindo cooperatividade negativa.

Aplicações biomédicas

A regulação alostérica constitui um importante alvo terapêutico. Um exemplo apresentado é a proteína tirosina fosfatase PTP1B, envolvida nas vias de sinalização da insulina e da leptina, cuja inibição poderá ter interesse no tratamento da diabetes, obesidade e outras patologias.

Conclusão

A regulação da velocidade das reações bioquímicas depende da integração de vários mecanismos, sendo a modulação da atividade enzimática o principal meio de controlo rápido do metabolismo. A regulação alostérica e as modificações covalentes permitem ajustar de forma eficiente o funcionamento das vias metabólicas às necessidades da célula.

Aula 9. Barreira Cinética I: Regulação da velocidade de uma reação

23 Março 2026, 12:00 • Federico Herrera Garcia

Esta aula aborda os principais mecanismos que regulam a velocidade das reações bioquímicas. O foco incide sobre a barreira cinética, explicando como a atividade das enzimas pode ser modulada para controlar o fluxo das vias metabólicas de forma rápida ou duradoura.

Mecanismos de regulação da velocidade

A velocidade de uma reação pode ser regulada através de três estratégias principais:

Disponibilidade do substrato.
Remoção do produto da reação.
Modulação da atividade ou da quantidade da enzima catalisadora.

Disponibilidade do substrato

A concentração de substrato pode influenciar a velocidade de determinadas reações, sobretudo quando a enzima não se encontra saturada. No entanto, este mecanismo nem sempre constitui um verdadeiro ponto de controlo metabólico, uma vez que muitas enzimas funcionam, em condições fisiológicas, próximas da saturação.

São discutidos exemplos como a hexoquinase, que se encontra normalmente saturada com glucose, e a glucoquinase hepática, cujo elevado Km lhe permite atuar como sensor da concentração de glucose.

Remoção do produto

A remoção dos produtos pode favorecer o avanço de reações próximas do equilíbrio, contribuindo para manter o fluxo metabólico. Este mecanismo é menos eficaz em reações muito afastadas do equilíbrio termodinâmico.

Modulação da atividade enzimática

A atividade das enzimas pode ser regulada rapidamente através de:

Regulação alostérica, em que a ligação de moléculas reguladoras altera a atividade da enzima.
Cooperatividade, característica de proteínas multiméricas, que modifica a afinidade para o substrato.
Modificações covalentes reversíveis, como a fosforilação, acetilação, metilação e oxidação, que alteram a atividade enzimática.