Sumários
Especificação celular 2
23 Fevereiro 2017, 17:30 • Solveig Thorsteinsdottir
Como se explica a formação de células diferentes? Conceito de equivalência genómica. Clonagem de organismos a partir de um núcleo de uma célula diferenciada prova o conceito de equivalência genómica (e.g Dolly). Estabelecida a equivalência genómica, pergunta-se como se formam células diferentes no embrião? A resposta é expressão génica diferencial. Definição de "expressão génica". Discussão breve sobre os níveis onde pode haver regulação da expressão génica.
O primeiro nível: a transcrição. Estrutura da cromatina, o gene, o promotor, os enhancers, factores de transcição (principais famílias) e os seus efeitos positivos ou negativos. O conceito de "constelação de fatores de transcrição". Exemplos de reprogramação nuclear (células iPS e outros exemplos). O segundo nível: o processamento do RNA nuclear e o transporte de mRNA para o citoplasma. Splicing alternativo permite a formação de multiplas proteínas a partir de um único gene. Exemplos (e.g. determinação do sexo em Drosophila, splicing alternativo de Dscam em Drosophila e em Vertebrados). O terceiro nível: inhibição selectiva de tradução do mRNA (e.g. através de determinadas proteínas que bloqueiam a tradução; através de miRNAs). Exemplos (e.g. a “limpeza” de mRNA maternos no embrião do peixe zebra; a hipertrofia muscular em carneiros devido a uma mutação no gene de miostatina levando a degradação do seu mRNA através de miRNAs). Quarto nível: processamento pós-traducionais de proteínas.
Fertilização e desenvolvimento no ouriço-do-mar
21 Fevereiro 2017, 13:00 • Solveig Thorsteinsdottir
Aula prática sobre a fertilização o desenvolvimento precoce no ouriço-do-mar.
Objectivo 1: Observação de oócitos e espermatozóides
Objectivo 2: Observação da fertilização.
Objectivo 3: Observação das modificações que ocorrem ao nível do núcleo e citoplasma até a primeira divisão mitotica. Observação da segunda clivagem. Opcional: obervação de gastrulas e larvas pluteus no dia seguinte.
Objectivo 4: Executar uma experiência que testa o efeito da concentração dos espermatozóides no (1) sucesso da fertilização e (2) a incidência de polispermia. Elaboração de um gráfico com os resultados obtidos.
Protocolo da aula
Observação de oócitos:
· Colocar uma gota de oócitos em água do mar numa lâmina e observar no microscópio (obj. 10x - não usar a objectiva de 40x!!). Identificar oócitos maduros e imaturos.
· Adicionar uma gota muito pequena de tinta de China e misturar com um palito. Observar a geleia.
Observação de espermatozóides:
(só podem usar a objectiva de 40x COM LAMELA - a água do mar destrói objectivas!).
· Preparar sémen diluído em água do mar. Observar com a objectiva de 10x sem lamela e depois colocar uma lamela e observar com a objectiva de 40x
Fertilização:
· Preparar uma caixa de Petri com oócitos em água do mar. Colocar uma gota de oócitos numa lâmina, colocar no microscópio e focar com a objectiva de 10x. Adiciona esperma diluído à caixa de Petri (vai ser usado para observar as fases de segmentação) e coloca uma gota de esperma na lâmina. Juntar a gota de esperma com a gota de oócitos usando um palito. Observar a fertilização.
Clivagem:
· Retirar uma gota de embriões em clivagem da caixa de Petri e observar sem lamela com a objectiva de 10x. Observar a 1ª divisão mitótica (±40-50 min após a fertilização), a 2ª divisão mitótica (10-15 min após a 1ª) e a 3ª divisão mitótica (? min após a 2ª).
Concentração do esperma e a poliespermia
1. em grupos de 4 (uma bancada) preparar 5 caixas de Petri (diâmetro 60 mm) com aproximadamente o mesmo número de oócitos em cada.
2. diluir 1 gota de sémen concentrado em 45 ml de água do mar
3. colocar 1, 5, 10, 20 e 40 gotas de semen diluido nas caixas com oócitos
4. deixar desenvolver durante 40-50 minutos
5. contar 50 oócitos ao acaso (de cada caixa) e classificar cada um num dos seguintes grupos:
I. não fertilizado
II. fertilizado e normal
III. fertilizado e poliespérmico
IV. outro
6. determinar se há uma correlação entre a quantidade de esperma administrado e a incidência de:
I. oócitos fertilizados
II. oócitos poliespermicos
NOTA! Devem dimunir ao máximo o “bias” do observador. Se as contagens envolvem várias pessoas, têm que ter certeza que classifiquem os oócitos da mesma maneira.
Fertilização e desenvolvimento no ouriço-do-mar
21 Fevereiro 2017, 08:00 • Solveig Thorsteinsdottir
Aula prática sobre a fertilização o desenvolvimento precoce no ouriço-do-mar.
Objectivo 1: Observação de oócitos e espermatozóides
Objectivo 2: Observação da fertilização.
Objectivo 3: Observação das modificações que ocorrem ao nível do núcleo e citoplasma até a primeira divisão mitotica. Observação da segunda clivagem. Opcional: obervação de gastrulas e larvas pluteus no dia seguinte.
Objectivo 4: Executar uma experiência que testa o efeito da concentração dos espermatozóides no (1) sucesso da fertilização e (2) a incidência de polispermia. Elaboração de um gráfico com os resultados obtidos.
Protocolo da aula
Observação de oócitos:
· Colocar uma gota de oócitos em água do mar numa lâmina e observar no microscópio (obj. 10x - não usar a objectiva de 40x!!). Identificar oócitos maduros e imaturos.
· Adicionar uma gota muito pequena de tinta de China e misturar com um palito. Observar a geleia.
Observação de espermatozóides:
(só podem usar a objectiva de 40x COM LAMELA - a água do mar destrói objectivas!).
· Preparar sémen diluído em água do mar. Observar com a objectiva de 10x sem lamela e depois colocar uma lamela e observar com a objectiva de 40x
Fertilização:
· Preparar uma caixa de Petri com oócitos em água do mar. Colocar uma gota de oócitos numa lâmina, colocar no microscópio e focar com a objectiva de 10x. Adiciona esperma diluído à caixa de Petri (vai ser usado para observar as fases de segmentação) e coloca uma gota de esperma na lâmina. Juntar a gota de esperma com a gota de oócitos usando um palito. Observar a fertilização.
Clivagem:
· Retirar uma gota de embriões em clivagem da caixa de Petri e observar sem lamela com a objectiva de 10x. Observar a 1ª divisão mitótica (±40-50 min após a fertilização), a 2ª divisão mitótica (10-15 min após a 1ª) e a 3ª divisão mitótica (? min após a 2ª).
Concentração do esperma e a poliespermia
1. em grupos de 4 (uma bancada) preparar 5 caixas de Petri (diâmetro 60 mm) com aproximadamente o mesmo número de oócitos em cada.
2. diluir 1 gota de sémen concentrado em 45 ml de água do mar
3. colocar 1, 5, 10, 20 e 40 gotas de semen diluido nas caixas com oócitos
4. deixar desenvolver durante 40-50 minutos
5. contar 50 oócitos ao acaso (de cada caixa) e classificar cada um num dos seguintes grupos:
I. não fertilizado
II. fertilizado e normal
III. fertilizado e poliespérmico
IV. outro
6. determinar se há uma correlação entre a quantidade de esperma administrado e a incidência de:
I. oócitos fertilizados
II. oócitos poliespermicos
NOTA! Devem dimunir ao máximo o “bias” do observador. Se as contagens envolvem várias pessoas, têm que ter certeza que classifiquem os oócitos da mesma maneira.
Fertilização no ouriço-do-mar | especificação celular durante o desenvolvimento 1
20 Fevereiro 2017, 15:00 • Solveig Thorsteinsdottir
A chegada das células precursoras dos gâmetas à gónada indiferenciada. Os gâmetas do ouriço-do-mar. A fertilização no ouriço-do-mar. A fertilização divide-se em quatro etapas:
1. Contacto e reconhecimento entre o espermatozóide e o oócito (espécie específico)
2. Regulação da entrada do espermatozóide pelo oócito (bloqueio a poliespermia)
3. Mistura do material genético dos gâmetas
4. Activação do metabolismo do oócito e o início do desenvolvimento.
A geleia do oócito liberta uma substrância (resact) que atrai o espermatozóide por quimiotaxia. Quando o espermatozoide toca na geleia inicia-se a reação acrossomal. As enzimas libertadas pelo acrossoma digerem a geleia e o espermatozóide chega à câmada vitelina onde se liga ao receptor de bindina, especie específico, que permite a fusão entre o espermatozóide e o oócito. Logo após a entrada do espermatozóide, o oócito activa duas defesas contra a poliespermia: o bloqueio rápido (despolarização da membrana do oócito) e o bloqueio lento (a exocitose dos grânulos corticais e o consequente afastamento da membrana de fertilização. Logo a seguir ocorre a activação do metabolismo do oócito e o desenvolvimento embrionário começa: o oócito fertilizado divide-se em blastómeros, uma fase chamada clivagem. Comparação com a clivagem de outros grupos animais.
Especificação celular: diferentes estratégias: especificação autónoma, especificação condicional, especificação em sincício.
Células primordiais germinais e os gametas
16 Fevereiro 2017, 17:30 • Solveig Thorsteinsdottir
A origem embrionária e o desenvolvimento das células primordiais germinais, as células precursoras dos gâmetas. O plasma germinal vs a indução das células primordias germinais. A hipotese do genoma inerte. A migração das células precursoras dos gâmetas e a sua chegada às gonadas.