Hibridação in situ dia 1

28 Março 2017, 08:00 • Solveig Thorsteinsdottir

O primeiro dia de hibridação in situ com os embriões de galinha obtidos na aula 3.

Dia 1 da hibridação in situ:

Rehidratação dos embriões:

1. Colocar em (encher 2/3 do tubo):

75% metanol em PBT 5 min

50% metanol em PBT 5 min

25% metanol em PBT 5 min

2. Lavar 2 vezes em PBT

Permeabilização e posterior fixação dos embriões:

3. Permeabilização dos embriões em proteinase K em PBT a 10 mg/ml (stock a 20 mg/ml: 25 µl PK – 50 ml PBT) a temperatura ambiente. O tempo de permeabilização depende do estádio do embrião (estádio HH = minutos; e.g. estádio HH10 = 10 min).
4. Lavar 2 vezes em PBT a temperatura ambiente. Cuidado: os embriões são frágeis!
5. Pós-fixação dos embriões durante 20 min a temperatura ambiente

Fixador (tóxico!!): 45 ml PBT + 5 ml formaldeído à 37% + 200 ml glutaraldeído à 25%

6. Lavar 2 vezes em PBT a temperatura ambiente

Preparação dos embriões para hibridação in situ:

7.  Passar por mistura PBT:Hibmix (1:1) (previamente aquecida até 70ºC)
8.  Passar por Hibmix (70ºC)
9.  Incubar em Hibmix durante 1 h a 70ºC

Hibridação in situ:

1. Tirar Hibmix e colocar Hibmix com sonda (só o suficiente para cobrir os embriões!) e incubar “overnight” a 70ºC*.

(Sonda tem todos os U’s conjugados com a proteina dioxigenina (DIG))

* temperatura depende das características da sonda

Gastrulação no embrião de anfíbio 1

27 Março 2017, 15:00 • Solveig Thorsteinsdottir

Gastrulação no embrião de anfíbio. Revisão dos principais conceitos. A formação do crescente cinzento, as experiências do Spemann e Mangold (1924) e a descoberta do Organizador. As experiências do Nieuwkoop e a definição do Centro de Nieuwkoop. Os mecanismos moleculares por detrás da indução do Centro de Nieuwkoop, as moléculas do Centro de Nieuwkoop e como essas regulam a ativação do Organizador. As moléculas do Organizador e como padronizam a mesoderme.

O desenvolvimento de Drosophila melanogaster parte 4 e comunicação célula-célula

23 Março 2017, 17:30 • Solveig Thorsteinsdottir

Continuação da abordagem sobre a cascata de genes que controla o desenvolvimento do eixo antero-posterior na Drosophila. Os genes maternos: bicoid, nanos, hunchback, caudal. Os mecanismos por de tras da criação de gradientes de concentração de bicoid, hunchbach e caudal. O mecanismo de activação dos genes gap. O mecanismo de activação dos genes de controlo par. A activação dos genes de polaridade segmentar.

Os genes homeóticos da Drosophila. Os mutantes homeóticos e.g. Antennapedia e Ultrabitorax. A regra da dominância dos genes homeóticos posteriores. Explicação dos fenótipos do mutante Ultrabitorax face a essa regra. Resumo do desenvolvimento da Drosophila.

Os fatores parácrinos (continuação). As principais famílias: Fibroblast growth factors, Hedgehogs, Wingless/Wnts, Transforming growth factors beta e outros factores parácrinos importantes. As vias de sinalização de cada uma das famílias e variações das mesmas dependentes do tipo célular. Exemplos concretos do papel da sinalização desencadeada de cada uma das famílias. Antagonistas e agonistas dos fatores parácrinos. Exemplos na Drosophila e nos Vertebrados.

Exemplos de complicações da teoria dos morfogénios.

Semana de intervalo 2

21 Março 2017, 13:00 • Solveig Thorsteinsdottir

A BDA tem uma carga horária de prática de 2h por semana. Por causa da natureza destas práticas, cada aluno tem 4h de aulas práticas 15 em 15 dias. Sendo assim nesta data não houve aula prática.

Semana de intervalo 2

21 Março 2017, 08:00 • Solveig Thorsteinsdottir

A BDA tem uma carga horária de prática de 2h por semana. Por causa da natureza destas práticas, cada aluno tem 4h de aulas práticas 15 em 15 dias. Sendo assim nesta data não houve aula prática.