Sumários

Hibridação in situ dias 2 e 3

4 Abril 2017, 13:00 • Solveig Thorsteinsdottir

Este procedimento foi feito nos dias 29 e 30 de março.

Continuação da aula anterior. Foi executado o protocolo do segundo e terceiro dia de hibridação in situ segundo o seguinte protocolo. Nota que os alunos fizeram esta aula no horário que tinham disponível nos dias 29 e 30 de março, totalizando 4 horas de aula.

 

Dia 2 da hibridação in situ:

 

Lavagens pós-hibridação:

  1.  Recuperar Hibmix com sonda (não deitar fora!!) e guardar a -20ºC.
  2.  Lavar os embriões 2 vezes com Hibmix previamente aquecida
  3.  Lavar 30 min com Hibmix a 70ºC (usar aprox. 1.5 ml)
  4.  Lavar 10 min com mistura Hibmix:MABT (1:1; previamente aquecida). Deixar a temperatura ambiente para arrefecer lentamente.
  5.  Lavar 2 vezes em TBST a temperatura ambiente
  6.  Lavar 15 min em TBST no “roller”

 

Preparação para detecção da sonda por imunohistoquímica:

  1. Incubar em TBST com 2% blocking e 20% soro de ovelha durante 1 h a temperatura ambiente no “roller”

 

Detecção da sonda por imunohistoquímica:

  1.  Adicionar o anticorpo anti-DIG conjugado com fosfatase alcalina (diluido 1:2000 em TBST com 2% blocking e 20% soro) e incubar “overnight” a 4ºC

 

Dia 3 da hibridação in situ

 

Lavagens pós-imunohistoquímica:

 

  1.  Lavar 3 vezes em TBST a temperatura ambiente
  2.  Lavar 3 vezes 1 hora em TBST com agitação a temperatura ambiente no “roller”
  3.  Deixar a 4ºC em TBST até a próxima aula

 

Hibridação in situ dias 2 e 3

4 Abril 2017, 08:00 • Solveig Thorsteinsdottir

Este procedimento foi feito nos dias 29 e 30 de março.

Continuação da aula anterior. Foi executado o protocolo do segundo e terceiro dia de hibridação in situ segundo o seguinte protocolo. Nota que os alunos fizeram esta aula no horário que tinham disponível nos dias 29 e 30 de março, totalizando 4 horas de aula.

 

Dia 2 da hibridação in situ:

 

Lavagens pós-hibridação:

  1.  Recuperar Hibmix com sonda (não deitar fora!!) e guardar a -20ºC.
  2.  Lavar os embriões 2 vezes com Hibmix previamente aquecida
  3.  Lavar 30 min com Hibmix a 70ºC (usar aprox. 1.5 ml)
  4.  Lavar 10 min com mistura Hibmix:MABT (1:1; previamente aquecida). Deixar a temperatura ambiente para arrefecer lentamente.
  5.  Lavar 2 vezes em TBST a temperatura ambiente
  6.  Lavar 15 min em TBST no “roller”

 

Preparação para detecção da sonda por imunohistoquímica:

  1. Incubar em TBST com 2% blocking e 20% soro de ovelha durante 1 h a temperatura ambiente no “roller”

 

Detecção da sonda por imunohistoquímica:

  1.  Adicionar o anticorpo anti-DIG conjugado com fosfatase alcalina (diluido 1:2000 em TBST com 2% blocking e 20% soro) e incubar “overnight” a 4ºC

 

Dia 3 da hibridação in situ

 

Lavagens pós-imunohistoquímica:

 

  1.  Lavar 3 vezes em TBST a temperatura ambiente
  2.  Lavar 3 vezes 1 hora em TBST com agitação a temperatura ambiente no “roller”
  3.  Deixar a 4ºC em TBST até a próxima aula

 

Gastrulação no embrião de anfíbio 3 e de peixe

3 Abril 2017, 15:00 • Solveig Thorsteinsdottir

Resumo da gastrulação no embrião de anfíbio: estabelecimento do eixo dorsal-ventral e anterior-posterior.

Gastrulação e a formação do eixo antero-posterior e polarização dorso-ventral em embriões de peixes. 

Gastrulação no embrião de anfíbio 2

30 Março 2017, 17:30 • Solveig Thorsteinsdottir

Continuação da abordagem das moléculas responsáveis para a indução do Organizador. A expressão dos antagonistas do BMP4 pelo organizador. O BMP4 como agente ventralizante e os seus antagonistas, expressos pelos derivados do Organizador, como contrabalançando o efeito ventralizante, permitindo o desenvolvimento de estruturas dorsais. O papel das primeiras células do Organizador a entrar na gastrula na padronização das estruturas anteriores. As experiências de Otto Mangold. Wnt8 como morfogénio caudalizante e a sua inibição por antagonistas (cerberus, frizbee, dickkopf) segregados pelos derivados do anteriores organizador (endoderme da faringe, mesenquima da cabeça).

O papel das primeiras células do Organizador a entrar na gastrula na padronização das estruturas anteriores. As experiências de Otto Mangold. Wnt8 como morfogénio caudalizante e a sua inibição por antagonistas (cerberus, frizbee, dickkopf) segregados pelos derivados do anteriores organizador (endoderme da faringe, mesenquima da cabeça). Gradiente de actividade Wnt8 na padronização do cérebro. 

Hibridação in situ dia 1

28 Março 2017, 13:00 • Solveig Thorsteinsdottir

O primeiro dia de hibridação in situ com os embriões de galinha obtidos na aula 3.

 

Dia 1 da hibridação in situ:

 

Rehidratação dos embriões:

 

  1. Colocar em (encher 2/3 do tubo):

75% metanol em PBT 5 min

50% metanol em PBT 5 min

25% metanol em PBT 5 min

  1. Lavar 2 vezes em PBT

 

Permeabilização e posterior fixação dos embriões:

 

  1. Permeabilização dos embriões em proteinase K em PBT a 10 mg/ml (stock a 20 mg/ml: 25 µl PK – 50 ml PBT) a temperatura ambiente. O tempo de permeabilização depende do estádio do embrião (estádio HH = minutos; e.g. estádio HH10 = 10 min).
  2. Lavar 2 vezes em PBT a temperatura ambiente. Cuidado: os embriões são frágeis!
  3. Pós-fixação dos embriões durante 20 min a temperatura ambiente

Fixador (tóxico!!): 45 ml PBT + 5 ml formaldeído à 37% + 200 ml glutaraldeído à 25%

  1. Lavar 2 vezes em PBT a temperatura ambiente

 

Preparação dos embriões para hibridação in situ:

 

  1.  Passar por mistura PBT:Hibmix (1:1) (previamente aquecida até 70ºC)
  2.  Passar por Hibmix (70ºC)
  3.  Incubar em Hibmix durante 1 h a 70ºC

 

Hibridação in situ:

 

  1. Tirar Hibmix e colocar Hibmix com sonda (só o suficiente para cobrir os embriões!) e incubar “overnight” a 70ºC*.

(Sonda tem todos os U’s conjugados com a proteina dioxigenina (DIG))

* temperatura depende das características da sonda